检测与成像
Western Blot 检测与成像：化学发光、荧光和采集检查
检测位于抗体孵育和定量之间。即使转膜和抗体结合都正常，二抗标记、底物、荧光通道、曝光或成像仪设置错误仍会导致结果失败。
先确认
先确认检测化学与抗体体系匹配
HRP 化学发光需要 HRP 标记二抗和兼容底物；荧光检测需要正确的荧光团和采集通道。用于定量时还必须保证信号处于检测器可用范围。
选择并核对检测体系
以抗体、底物和成像仪说明为起点，不要把另一套检测化学或另一台仪器的曝光条件直接照搬。
化学发光
核对 HRP 二抗、底物配制和膜覆盖。建议采集不同曝光，因为信号变化快且可能在肉眼不明显时已经饱和。
荧光
让二抗荧光团与仪器通道匹配，多重检测时还要避免明显光谱冲突。
成像仪检查
核对通道、托盘/焦点、曝光或 gain，并确认仪器能检出已知阳性信号。
定量采集
目标和归一化信号都应未饱和并处于可用响应范围；图像好看并不等于可以定量。
建议记录
✓二抗标记方式和货号。
✓检测化学、底物批次和配制。
✓成像仪型号、通道和采集设置。
✓适用时保存从短到长的曝光序列。
✓保存未裁切原始文件而不是只留截图。
✓定量前检查饱和和线性范围。
常见检测失败
先用直接检测信息判断，再回到更上游。
观察到
转膜正常但 HRP 体系完全无信号
更可能提示
二抗不匹配、HRP/底物失效、配制或采集问题可能参与。
下一步
核对二抗特异性/标记，使用新鲜兼容底物，并用已知阳性信号检查成像。
先不要做
不要立刻增加一抗。
观察到
只有某个荧光通道空白，其他通道正常
更可能提示
荧光团/通道不匹配、滤光设置或二抗故障更可疑。
下一步
核对荧光团光谱、指定通道和二抗标记。
先不要做
先不要因为一个光学通道失败就重做转膜。
观察到
强条带顶部被截平，弱条带仍可见
更可能提示
检测器很可能已经饱和。
下一步
降低曝光/gain 或信号强度并重新采集。
先不要做
不要定量饱和像素，也不要靠后期调图恢复。
观察到
底物积液或膜褶皱处信号明显更强
更可能提示
检测化学覆盖而不是生物学参与了差异。
下一步
均匀加底物、展平膜并清洁成像表面。
先不要做
不要把积液位置解释成蛋白更高。
相关专题
技术参考
具体成像仪、荧光团和底物说明优先于通用建议。
- Thermo Fisher Scientific — Overview of Western Blotting
用于检测、化学发光、荧光和成像流程说明。
- Cell Signaling Technology — Western Blot Protocol
用于完整抗体/检测流程和产品操作背景。
- Thermo Fisher Scientific — Western Blotting Troubleshooting
用于弱/无检测信号、高背景、底物和抗体体系排查。