Western Blot 实验计算
Western Blot 实验计算工具
这些工具用于计算体积和稀释，并提示单位、体积和移液范围问题。具体实验条件仍需结合抗体说明书、凝胶分离范围、膜说明书和预实验确定。
从实验问题选择计算工具
计算体积前，先确定浓度和质量代表什么。工具会给出配制量，但不会替你选择抗体的最优稀释、证明条带身份或验证定量范围。各工具后有固定算例，便于手工复核。
- 已测浓度，需要算每孔体积 ↓
- 先把 ng 换为 µg，确认是总裂解液还是纯化蛋白，再计算样本体积。
- 样本、上样液与还原剂要放进同一孔 ↓
- 分别保留独立样本，计入全部组分；负稀释液表示配方不适配。
- 抗体取量太小，想做中间稀释 ↓
- 同时核对原抗体取量、中间液取量和足够的制备体积。
- 目标与参照分子量相差较大 ↓
- 查看分离范围提示，再查具体凝胶和转膜系统；提示不是已验证的胶浓度。
蛋白上样体积
浓度单位固定为 µg/µL，拟上样质量固定为 µg，结果直接为 µL。
裂解液浓度与质量指总蛋白，不是其中的目标蛋白。纯化蛋白输入也需核对纯度。体积计算不证明该上样量处于检测线性范围。
单一样本的上样混合液与批量体积
计算每孔样品、上样液、可选还原剂和补水体积，并按孔数和额外损耗生成整批用量。
仅适合同一浓度样本的批量计算；不同样本浓度应分别计算样品和补水。
按 1:N 配制抗体，并自动建议中间稀释
当直接吸取体积低于移液器可靠范围时，自动选择一个可操作的中间稀释倍数。
中间液制备与取用都要达到可靠移液体积。使用兼容稀释液，考虑吸附、器具损耗和保存稳定性；余量为理论值，未扣除死体积。
C₁V₁ = C₂V₂
储液和终浓度必须使用同一种浓度单位；最终体积使用 mL。
TBST 中 Tween-20 体积
按最终体积和目标体积分数计算。常用 0.1% 只是起点，应服从抗体专属协议。
凝胶范围与转膜风险助手
根据目标和归一化蛋白分子量提示需要核对的凝胶范围、是否值得比较梯度胶，以及小分子保留风险。
本工具不输出万能凝胶百分比；最终选择必须核对具体凝胶厂商的分离范围图。
从算式到实验记录
计算公式、算例与使用说明
下面用具体数字演示各项计算。使用结果前，请确认单位、配方和移液量适合自己的抗体、样本及设备。
1. 蛋白上样：把质量换成裂解液体积
打开计算器 ↑裂解液体积（µL）= 目标质量（µg）÷ 浓度（µg/µL）
从 2 µg/µL 裂解液中取 10 µg，每泳道需要 10 ÷ 2 = 5 µL 裂解液。2 mg/mL 与 2 µg/µL 数值相同；2 µg/mL 则不是。本结果仅为样本体积，还未加入上样缓冲液、还原剂或稀释液。
- 记到实验记录里
- 记录样本编号、蛋白定量方法及稀释倍数、测得浓度、目标质量和算出的裂解液体积。若测定时先稀释，应正确应用稀释倍数后，才使用原始裂解液浓度。
- 计算之后还要核对
- 不兼容的去垢剂或还原剂可能影响浓度测定。工具无法验证定量方法、泳道容量或靶标/参照的响应范围。用预实验上样梯度确认，并包括预期信号最强的实验组样本。
2. 上样混合液：计入还原剂和批次余量
打开计算器 ↑上样缓冲液体积 = 每孔最终体积 ÷ 浓缩倍数
稀释液 = 最终体积 − 样本 − 上样缓冲液 − 单独加入的还原剂
批次乘数 = 整数孔数 ×（1 + 余量百分比 ÷ 100）
2 µg/µL 样本取 10 µg，每孔最终 20 µL，可配成 5 µL 样本 + 5 µL 4× 上样液 + 1 µL 单独还原剂 + 9 µL 稀释液。6 孔加 10% 余量，乘数为 6.6：整批为样本 33 µL、上样液 33 µL、还原剂 6.6 µL、稀释液 59.4 µL，总量 132 µL。实际每孔仍加 20 µL；6.6 是制备余量折算，不是允许半个泳道。
- 记到实验记录里
- 同时记录单孔配方与批次总量、还原剂名称/储液浓度、最终体积、实际孔数和余量比例。额外的 1 µL 还原剂只是算术示例，不是推荐浓度；其体积应由储液和所需终浓度推算。
- 计算之后还要核对
- 这个合并配方适用于同一均一样本的重复泳道，不能把独立生物样本混成一管。浓度不同时分别计算样本和稀释液。还原剂只计一次；上样液已含还原剂时，单独还原剂应填零。稀释液为负说明配方无法容纳，需重新设计。
3. 抗体 1:N：使用最终孵育体积
打开计算器 ↑最终体积（µL）= 体积（mL）× 1,000
原抗体体积 = 最终体积 ÷ N
配最终 5 mL、1:5,000 抗体孵育液，5 mL = 5,000 µL，需要原抗体 5,000 ÷ 5,000 = 1 µL。将 1 µL 抗体加入 4,999 µL 兼容稀释液，得到 5,000 µL 孵育液。先取完整 5 mL 稀释液再加抗体，会改变最终体积。
- 记到实验记录里
- 记录抗体货号和批号、稀释倍数、最终体积、稀释液、孵育时间和温度，以及直接法还是中间稀释法。以该抗体已验证的专属条件作为起点。
- 计算之后还要核对
- 稀释比不能证明特异性或最优信噪比。确认 1 µL 是否落在实际移液器的可靠范围内；器具显示这个刻度不等于操作精确。更换批号、检测方法或样本后，按原因重新优化。
4. 中间稀释：两次移液都必须可操作
打开计算器 ↑制备中间液时的原液体积 = 中间液制备体积 ÷ 倍数 F
最终取用中间液 =（最终体积 ÷ N）× F
中间液至少需配 ≥ max（F × 最小可靠取量，最终中间液取量）
最终 5 mL、1:20,000 的直接取量只有 0.25 µL。若最小可靠取量为 1 µL，可用 10 µL 原抗体 + 90 µL 兼容稀释液，先配 100 µL 的 1:10 中间液。再取其中 2.5 µL，加 4,997.5 µL 最终稀释液。总稀释倍数 = 10 ×（5,000 ÷ 2.5）= 20,000；未计损耗的中间液余量为 97.5 µL。
- 记到实验记录里
- 记录原抗体取量、中间倍数、制备体积、最终取用量、最终稀释液体积和制备时间。只记“1:20,000”不够，额外稀释步骤会影响误差、吸附和可复现性。
- 计算之后还要核对
- 最终中间液取量够大，不代表原抗体取量够大。若最小可靠取量为 25 µL，拟配 100 µL 的 1:50 中间液需要原液 2 µL，无法接受；至少改配 1,250 µL，原液才达到 25 µL，还应另留死体积。中间液要兼容且可能需现配，不能默认可长期保存。
5. C₁V₁ = C₂V₂：浓度单位要一致
打开计算器 ↑储液体积 V₁ = C₂ × V₂ ÷ C₁
稀释液体积 = V₂ − V₁
从 10× 储液配 100 mL 的 1× 缓冲液，V₁ = 1 × 100 ÷ 10 = 10 mL 储液。加兼容稀释液至最终 100 mL，理论稀释液体积为 90 mL。同样可用于 10 mM 稀释到 1 mM；把 10 mg/mL 与 1 mM 混填则不成立。
- 记到实验记录里
- 记录储液名称、浓度及其单位、所需终浓度与最终体积、储液取量和稀释液。质量浓度换为摩尔浓度时，先按确切化合物的分子量及具体形式换算，再使用本工具。
- 计算之后还要核对
- 本公式只做稀释，不能把更弱储液变成更浓溶液。另行检查溶解度、pH、兼容性和储液稳定性。最终体积需要精确时采用定容，不能默认各组分体积完全可加。
6. 0.1% TBST：体积分数以最终体积为分母
打开计算器 ↑Tween-20（µL）= 最终体积（mL）× 1,000 ×（% v/v ÷ 100）
最终 1,000 mL 的 0.1% v/v TBST，需要 1,000 × 1,000 × 0.001 = 1,000 µL Tween-20，即 1 mL。工具给出的基础缓冲液约为 999 mL。若从 10× TBS 配制且要求严格保留 1× TBS，可取 100 mL 10× TBS、1 mL Tween-20，加水定容至 1,000 mL；理论水量 899 mL。
- 记到实验记录里
- 明确记录 0.1% v/v、最终体积、TBS 储液与终浓度、Tween-20 名称和配制日期。若配 100 mL，同一公式给出 100 µL Tween-20。注明用的是原液还是已稀释的去垢剂储液。
- 计算之后还要核对
- 输入 0.1 表示 0.1%，工具还会除以 100，不能把它当成 0.1 的小数比例。本计算假设未稀释 Tween-20；使用 10% 储液时需另做 C₁V₁ 计算。Tween 黏稠，应采用适当移液方式并混匀。具体抗体协议可能要求其他去垢剂浓度。
7. 凝胶选择：检查分离范围
打开计算器 ↑分子量比值 = 较大分子量 ÷ 较小分子量
比值 ≥ 3 或差值 ≥ 80 kDa 时，提示比较梯度胶/分开检测
150 kDa 靶标与 42 kDa 内参，分子量比值为 150 ÷ 42 = 3.57，差值为 108 kDa，均触发较宽分离范围的提示。接下来应查该凝胶型号的厂商分离图，并规划大分子转膜；工具没有给出已经验证的万能胶浓度。
- 记到实验记录里
- 记录预期表观分子量及其依据、凝胶型号/浓度或梯度、Marker 范围、膜和转膜系统。说明靶标与参照是同时获取，还是采用了有依据的分开检测策略。
- 计算之后还要核对
- 上述比值与差值是本站决策提示，不是实验验证阈值或厂商规格。修饰、剪切、异构体和样本处理都可能改变迁移。需实测身份、分离和转膜效果；小分子目标还应排查穿膜损失。
公式是质量、浓度或体积关系；凝胶筛查规则属于本站提示。实际配方参见 Cell Signaling Technology — Western Blotting Protocol，并以具体抗体、上样液和凝胶产品说明为准。
移液前核对
- • 确认输入单位与标签一致；mg/mL 和 µg/mL 需要先换算后再代入公式。
- • 确认计算结果处于移液器的可靠范围；体积过小时采用中间稀释，并记录中间液的配制方式。
- • 确认最终体积中是否还需要加入封闭剂、盐、去污剂、还原剂或其他组分。
- • 记录实际加入体积以及与理论值不同的操作。
- • 凝胶与膜的选择仍需核对具体厂商分离范围和转膜系统说明。
把计算结果写入实验记录单
记录实际体积、抗体批次、转膜条件和成像设置。
核对参数依据
计算结果还需要结合具体实验设计和产品条件判断。