定量与归一化
Western Blot 定量：线性范围、饱和与归一化
进行灰度定量前，应先确认目标和归一化信号均处于可用响应范围。软件能够从条带得到数值，并不代表该数值与蛋白量保持比例关系；饱和信号尤其不能用于可靠的相对定量。
本页解决的问题
定量前先确认信号范围
Housekeeping protein 往往丰度较高，可能在低丰度目标刚刚可见之前就已经饱和，其表达也可能随处理变化。总蛋白归一化可以减少对单一 housekeeping protein 的依赖，但所用总蛋白方法同样需要与流程兼容并验证响应范围。
灰度分析前需要满足的条件
定量分析至少需要满足以下条件。
目标信号未饱和
目标必须处于检测器和整套实验的可用响应范围。纯黑条带不能证明信号与蛋白量成比例。
归一化信号经过验证
Housekeeping protein 必须在当前处理条件下稳定，而且其免疫检测信号也处于自身线性范围。
β-actin、GAPDH 和 tubulin 在使用前均需验证稳定性和线性范围。
共同可用样本范围
用于比较的样本量范围内，目标和内部 loading control 都必须能够可靠定量。
统一采集与分析规则
样本之间需要使用一致的采集、背景处理、ROI 定义和计算规则。
归一化方法的选择
归一化方法也属于测量体系的一部分；饱和或生物学不稳定的内参不能通过后期计算修正。
Housekeeping protein
只有确认其在当前实验中稳定，并且在所选上样量下免疫信号处于线性范围，才能作为归一化参考。
总蛋白归一化
利用整条泳道总蛋白而非单个 housekeeping band，可减少部分单蛋白假设；具体总蛋白方法仍需与后续流程兼容并验证范围。
样本梯度
系列上样可以显示目标和归一化信号在哪个样本区间保持比例响应，以及从哪里开始饱和。
曝光系列
多曝光有助于识别检测器饱和；若非线性来自过高样本量、抗体放大或底物，单纯缩短曝光并不能修复整个实验的响应关系。
Western Blot 定量流程
1. 建立样本上样梯度
怎么做
使用同一基质和制备方式，设计覆盖计划上样量上下范围的系列样本。
当场检查
分别观察目标和归一化信号随样本量的变化，而不是只看条带深浅。
何时停下来处理
响应进入平台或出现非单调变化时，该区域不适合定量比较。
2. 确认目标与归一化信号的共同可用范围
怎么做
确定两者都未饱和，并在计划比较的样本范围内保持足够比例响应的区间。
当场检查
先分别检查目标和归一化信号，再计算比值。
何时停下来处理
如果为了看到目标所需的上样量已经让 housekeeping protein 饱和，应更换归一化策略或重新优化检测。
3. 验证归一化的生物学稳定性
怎么做
确认选定 housekeeping protein 在各处理条件下稳定，或者使用经过验证的总蛋白方法。
当场检查
计算目标/内参比值前先查看原始内参值。
何时停下来处理
内参本身随处理变化时，不能继续用它校正目标。
4. 固定分析规则进行定量
怎么做
在原始未饱和数据上使用一致的 ROI、背景和计算方法。
当场检查
把未裁切原图、原始测量值和归一化计算保存在一起。
何时停下来处理
分析前已使用不同方式裁切、调整对比度或有损导出时，应回到原始数据。
5. 区分生物学重复和技术测量
怎么做
根据真实实验设计汇总独立生物学重复，并选择匹配的统计分析。
当场检查
保留每个独立重复的单独数值，并区分 biological 与 technical replicate。
何时停下来处理
同一样本的多个曝光或重复读数不能当成独立生物学样本扩充 n。
建议保留的信息
线性范围或归一化不合格时的处理
线性或归一化验证失败时，应重新调整样本、检测或归一化方案，不能从饱和数据中强行计算比值。
观察
目标条带已经饱和
解释
信号不再与目标丰度保持比例。
下一步
根据原因降低样本量、抗体放大或曝光，并重新建立可用范围。
先不要做
饱和图像不能通过后期调对比度恢复为可定量数据。
观察
Housekeeping band 已饱和，但目标仍很弱
解释
当前上样量下，目标与 housekeeping protein 没有共同可用的免疫检测范围。
下一步
改用丰度更合适且经过验证的内参、总蛋白归一化，或重新优化样本/检测条件。
先不要做
housekeeping band 每道都很黑时，不能据此认为上样量相同。
观察
Housekeeping protein 随处理改变
解释
内参的生物学变化会扭曲归一化后的目标变化。
下一步
选择并验证其他内参，或使用合适的总蛋白方法。
先不要做
过去一直使用某个内参不能作为继续使用的充分理由。
观察
需要比较不同 blot
解释
不同膜之间的变异增加了额外测量误差。
下一步
预先设计共同参考样本/对照，并使用明确处理跨膜差异的归一化策略。
先不要做
不同膜、不同采集条件下的原始灰度不能直接比较。
观察
上样梯度响应弯曲或出现平台
解释
至少部分区间已经超出比例响应范围。
下一步
只使用验证过的区域，或重新优化抗体、样本量和检测条件。
先不要做
最高信号点不一定是最佳定量点。
相关实验指南
主要技术来源
这些资料都要求目标和归一化信号先在可用测量范围内完成验证，再把 Western Blot 比值用于定量解释。
- LI-COR — Quantitative Western Blot: Total Protein Stain + Target Linear Range Workflow
用于核对目标与内部 loading control 的共同线性样本范围，以及通过样本梯度建立工作范围的方法。
- Bio-Rad — Total Protein Normalization
用于核对 housekeeping protein 饱和和生物学不稳定问题，以及总蛋白归一化。
- Thermo Fisher Scientific — Quantitative Western Blot Analysis
用于核对样本量、抗体量、饱和和 assay linearity 对定量化学发光 Western Blot 的影响。