Western Blot 定量：线性范围、饱和与归一化

1. 从原图定义 ROI 和背景

分析前先确认靶标、参照和最强实验组都处于已验证的未饱和范围。本例用于练习计算，模拟数据不能代替样本的上样预实验。使用原始、未截顶的无损图像，保留采集设置；不能从压缩截图、不同对比度的展示图或裁剪后丢失背景的图像恢复可靠的强度。

在 ImageJ 中保存 ROI 集，记录 RawIntDen、面积和邻近背景均值。先统一强度方向，使更强信号对应更高数值；不同显色图像可能需要一致的反相规则，不能把黑色条带的低像素值直接当成高信号。固定尺寸 ROI 应覆盖完整目标条带，避免混入其他条带；局部背景取同泳道邻近的无条带区域，并记录选择规则。

2. 对靶标与内参分别扣除背景

C1 的原始积分强度 18,000，包括背景贡献 400 × 20 = 8,000，扣除后为 10,000。减去背景均值 20 本身会得到 17,980，这是把“强度总和”和“每像素强度”混用。如果背景 ROI 有 200 像素、像素总和为 4,000，其均值仍为 20；应该扣除的仍是条带 ROI 的 400 × 20，而不是背景 ROI 的面积。

这里面积以像素数记录，强度是未标定的像素和。ImageJ 的 IntDen 在标定图像中涉及面积和灰度标定，因此不能直接把 µm² 面积代入本公式而仍使用未标定 RawIntDen。ROI 比条带稍大本身不一定改变正确扣背景后的信号，但背景估计偏差会按 ROI 面积放大。若扣除后为零、负数或接近背景，应标记低于可靠测量范围，不要取绝对值、截成零后继续计算倍数，或只保留好看的样本。

3. 逐样本归一化，再相对于对照均值

对照比值的均值是 (0.50 + 0.60 + 0.40) ÷ 3 = 0.50。T1 靶标为 29,000 − 400 × 25 = 19,000，内参为 25,200 − 400 × 13 = 20,000，因此样本比值为 0.95，相对值为 0.95 ÷ 0.50 = 1.90。三个处理样本相对值的均值为 (1.90 + 2.00 + 2.10) ÷ 3 = 2.00。

4. 把测量重复和生物学重复分开

模拟数据的 C1–C3 与 T1–T3 被定义为各组三份独立生物样本，因此每组教学 n = 3。C1 的短、中、长三次曝光仍是同一样本，重画 ROI 三次也是技术重复；二者都不能把 n 从 3 增加为 9。不要混用各泳道各自的“最好看”曝光，除非有已验证、可校准的跨曝光方法。

真实报告保留每个生物样本的点、原始未裁剪图像、排除依据和分析规则。独立组与配对设计的统计方法不同：若实验本身配对，应采用预先设定的配对分析，而不是事后假定本表 C1 与 T1 配对。这里用对照均值归一化演示公式，没有给 p 值或显著性结论，也不代表一张膜可以支持普遍的生物学结论。