RIPA 裂解缓冲液

放射免疫沉淀测定缓冲液 - western blotting 中最常用于细胞裂解

Components

• 50 mM Tris-HCl，pH 7.4
• 150 mM NaCl
• 1% NP-40（或 IGEPAL CA-630）
• 0.5% 脱氧胆酸钠
• 0.1% SDS
• 使用前新鲜添加：1 mM PMSF、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂

Preparation

在去离子水中溶解组分，将 pH 调节至 7.4，过滤灭菌，在 4°C 储存。使用前立即添加抑制剂。最终体积：1 L。

Laemmli 样品缓冲液（2X）

SDS-PAGE 电泳的标准样品缓冲液

Components

• 125 mM Tris-HCl，pH 6.8
• 4% SDS
• 20% 甘油
• 0.004% 溴酚蓝
• 10% 2-巯基乙醇（新鲜添加，或使用 100 mM DTT）

Preparation

混合组分（还原剂除外），在室温储存。使用前立即添加还原剂。对于 2X 缓冲液，与样品 1:1 混合。对于还原条件，始终添加新鲜的 2-ME 或 DTT。

湿转缓冲液

用于将蛋白质从凝胶转移到 PVDF 或硝酸纤维素膜

Components

• 25 mM Tris 碱
• 192 mM 甘氨酸
• 20% 甲醇（用于 PVDF 膜）
• 0.1% SDS（可选，用于大蛋白质 >100 kDa）

Preparation

在 800 mL 去离子水中溶解 3.03 g Tris 碱和 14.4 g 甘氨酸，添加 200 mL 甲醇，将 pH 调节至 8.3，定容至 1 L。在 4°C 储存。对于硝酸纤维素，将甲醇减少至 10-15%。

TBST（含 Tween-20 的 Tris 缓冲盐水）

Western blotting 的标准洗涤和封闭缓冲液

Components

• 20 mM Tris-HCl，pH 7.6
• 150 mM NaCl
• 0.1% Tween-20

Preparation

在 900 mL 去离子水中溶解 2.42 g Tris 碱和 8.77 g NaCl，用 HCl 将 pH 调节至 7.6，添加 1 mL Tween-20，定容至 1 L，充分混合。在室温储存。

5% 脱脂牛奶 TBST

大多数 western blot 应用的标准封闭溶液

Preparation

将 5 g 脱脂奶粉溶解在 100 mL TBST 中。充分混合，可能需要通过粗棉布过滤以去除未溶解的颗粒。新鲜制备或在 4°C 储存最多 1 周。使用前充分摇动。

3-5% BSA TBST

用于磷酸化蛋白质或当牛奶导致高背景时的封闭溶液

Preparation

将 3-5 g BSA（牛血清白蛋白，Fraction V）溶解在 100 mL TBST 中。轻轻混合以避免起泡。如有必要，通过 0.45 μm 过滤器过滤。在 4°C 储存。在 1 周内使用。

Ponceau S 染色液

用于可视化膜上的蛋白质转膜

Components

• 0.1% Ponceau S
• 5% 乙酸

Preparation

将 0.1 g Ponceau S 溶解在 100 mL 5% 乙酸中。使用前过滤。在室温储存。染色膜 2-5 分钟，用水冲洗以可视化条带。