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正确的样品制备对于成功的 western blotting 至关重要。本节介绍从不同来源制备样品的详细方法，包含逐步说明。

细胞裂解物制备

从培养细胞制备蛋白质裂解物的详细protocol。正确的裂解条件对于维持蛋白质完整性和防止降解至关重要。

1
去除培养基，用冰预冷的 PBS（磷酸盐缓冲盐水）洗涤细胞 2-3 次。确保完全去除所有 PBS，以避免稀释裂解缓冲液。对于贴壁细胞，直接将 PBS 加入培养皿。对于悬浮细胞，通过 500-1000 × g 离心 5 分钟使细胞沉淀。
2
制备新鲜的裂解缓冲液或使用储存在 -20°C 的分装缓冲液。使用前立即添加蛋白酶抑制剂（例如，PMSF 终浓度为 1 mM，或商业蛋白酶抑制剂混合物）和磷酸酶抑制剂（例如，NaF 10 mM，Na3VO4 1 mM）。整个过程保持缓冲液冰预冷。
3
添加适当体积的裂解缓冲液（通常每 10^6 个细胞 100-200 μL 或每 cm² 培养皿 100-150 μL）。对于贴壁细胞，使用细胞刮刀直接在裂解缓冲液中刮取细胞。对于悬浮细胞，将沉淀重悬于裂解缓冲液中。转移到预冷的微量离心管中。
4
在冰上孵育 20-30 分钟，每 5-10 分钟轻轻涡旋一次。对于难以裂解的细胞，可以将孵育时间延长至 45 分钟或进行超声处理（在冰上每次 10 秒，共 3-5 次脉冲）。
5
在 4°C 下以 12,000-14,000 × g 离心 15 分钟。这可以去除细胞碎片、细胞核和不溶性物质。对于某些应用，可能需要以更高速度（20,000 × g）离心或进行连续离心。
6
小心收集上清液，不要扰动沉淀。转移到新的预冷管中。避免收集任何沉淀物质，因为它可能含有会干扰电泳的不溶性聚集体。
7
使用 BCA、Bradford 或 Lowry 测定法确定蛋白质浓度。始终使用 BSA 标准品制备标准曲线。如有必要，稀释样品以使其落在测定的线性范围内。细胞裂解物的典型浓度范围为 1-10 mg/mL。

Tips:

快速操作并保持所有物品在冰上以防止蛋白质降解
使用新鲜的蛋白酶抑制剂，因为它们会随时间降解
对于磷酸化蛋白质，磷酸酶抑制剂是必需的
避免过度涡旋，这可能导致起泡和蛋白质变性
如果不立即使用，将裂解物储存在 -80°C

组织样品制备

从组织样品制备蛋白质提取物的protocol。组织匀浆需要比细胞裂解更剧烈的方法。

1
收集新鲜组织并立即放在冰上或在液氮中快速冷冻。对于冷冻组织，保持冷冻直到准备处理。使用手术刀或剃须刀片在冷却表面上将组织切成小块（2-3 mm³）。
2
在冰预冷的裂解缓冲液中匀浆组织（通常每重量组织 10-20 倍体积的缓冲液，例如，100 mg 组织在 1-2 mL 缓冲液中）。使用机械匀浆器、研钵和研杵或珠击系统。对于坚韧的组织，在多个短脉冲（每次 10-15 秒）中进行匀浆，间隔冷却。
3
在冰上孵育匀浆物 30 分钟，偶尔涡旋。对于纤维组织，将孵育时间延长至 45-60 分钟。某些组织可能受益于短暂超声处理（在冰上每次 5 秒，共 3-5 次脉冲）。
4
在 4°C 下以 12,000-14,000 × g 离心 20 分钟。对于高脂含量的组织，可能需要以更高速度离心或进行额外的离心步骤。
5
如果上清液含有可见碎片或浑浊，通过 0.45 μm 注射器过滤器过滤或再次离心。某些protocol建议通过粗棉布或细网过滤。
6
确定蛋白质浓度。组织提取物通常比细胞裂解物具有更高的蛋白质浓度（5-20 mg/mL）。根据需要稀释用于定量测定。

Tips:

保持组织冷冻直到处理以防止蛋白质降解
根据组织类型使用适当的匀浆方法
某些组织可能需要额外步骤以去除脂质或结缔组织
在 -80°C 分装储存提取物以避免冻融循环

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蛋白质定量

准确的蛋白质定量对于加载等量的蛋白质至关重要。根据制造商的说明使用 BCA、Bradford 或 Lowry 测定法。始终制备标准曲线以进行准确的定量。

SDS-PAGE 电泳

SDS-PAGE 根据分子量分离蛋白质。正确的凝胶制备和运行条件对分辨率至关重要。本节提供制备和运行 SDS-PAGE 凝胶的详细逐步说明。

所需材料：

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30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液（29:1 或 37.5:1 比例）
1.5 M Tris-HCl，pH 8.8（用于分离胶）
0.5 M Tris-HCl，pH 6.8（用于浓缩胶）
10% SDS（十二烷基硫酸钠）
10% APS（过硫酸铵）- 新鲜制备
TEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺）
去离子水
凝胶浇注系统（玻璃板、间隔条、梳子）
异丙醇或水饱和丁醇（用于覆盖）

分离胶制备（10% 示例）：

1
计算体积:对于 10% 分离胶（总共 10 mL）：混合 3.3 mL 30% 丙烯酰胺、2.5 mL 1.5 M Tris-HCl pH 8.8、0.1 mL 10% SDS、4.05 mL 去离子水。在真空下脱气 10-15 分钟以去除溶解的氧气。
2
添加聚合剂:添加 50 μL 10% APS 和 10 μL TEMED。通过轻轻旋转混合（不要涡旋，因为这会引入气泡）。立即倒入凝胶盒中，距离梳子将放置的位置约 1 cm。
3
覆盖:小心地用异丙醇或水饱和丁醇覆盖，以防止氧气接触并形成平坦的凝胶表面。在室温下聚合 30-45 分钟。当聚合完成时，您会看到清晰的界面。
4
去除覆盖层:倒出覆盖层并用去离子水冲洗凝胶顶部。用滤纸擦干顶部表面，注意不要触摸凝胶。

凝胶百分比指南：

6-8%：用于 >100 kDa 的蛋白质（大蛋白质）
10%：用于 30-100 kDa 的蛋白质（最常用，通用）
12%：用于 15-60 kDa 的蛋白质
15%：用于 10-40 kDa 的蛋白质
18-20%：用于 <20 kDa 的蛋白质（小蛋白质）

浓缩胶制备（5%）：

1
制备浓缩胶溶液:对于 5% 浓缩胶（总共 4 mL）：混合 0.67 mL 30% 丙烯酰胺、1.0 mL 0.5 M Tris-HCl pH 6.8、0.04 mL 10% SDS、2.25 mL 去离子水。如有时间，进行脱气。
2
添加聚合剂:添加 25 μL 10% APS 和 5 μL TEMED。轻轻混合并立即倒在分离胶顶部。
3
插入梳子:快速以一定角度插入梳子以避免气泡，然后拉直。聚合 20-30 分钟。当您可以在梳子齿处看到清晰的线时，凝胶应该准备好了。
4
移除梳子:小心地移除梳子并用运行缓冲液或去离子水冲洗孔以去除未聚合的丙烯酰胺。凝胶现在可以加载样品了。

样品加载：

1
在 Laemmli 样品缓冲液（最终浓度 1X）中制备样品，每孔 20-50 μg 蛋白质。对于高表达蛋白质，使用 10-20 μg。对于低丰度蛋白质，您可能需要 50-100 μg。
2
至少在一个孔中包含分子量标记。预染色标记允许您在电泳过程中监控进度。
3
使用移液器小心地加载样品，避免气泡。缓慢加载以防止样品溢出到相邻孔中。
4
用 1X 样品缓冲液填充任何空孔以确保电流均匀分布。

提高分辨率的技巧

使用新鲜的 APS 和 TEMED 进行凝胶聚合 - 旧试剂可能无法正常工作
在添加 APS 之前对凝胶溶液进行脱气，以防止可能破坏凝胶结构的气泡
在使用前让凝胶完全聚合 - 不完全聚合导致分辨率差
为您的蛋白质大小使用适当的凝胶百分比 - 错误的百分比导致分离差
在电泳过程中保持一致的温度 - 温度波动影响迁移
确保缓冲液水平充足 - 低缓冲液导致运行不均匀
使用新鲜的运行缓冲液 - 旧缓冲液可能具有不正确的 pH 或电导率
避免过载样品 - 过多的蛋白质导致条带拖尾
尽可能加载等体积 - 不同体积可能导致泳道变形

蛋白质转膜方法

将蛋白质从凝胶转移到膜是关键步骤，决定了检测灵敏度。本节提供不同转膜方法的详细protocol。

PVDF 膜（推荐）：

1
将膜切割至适当大小（略大于凝胶）
2
通过在 100% 甲醇中浸泡 30 秒来激活膜
3
转移到转膜缓冲液并平衡 5 分钟
4
PVDF 膜比硝酸纤维素膜具有更好的蛋白质结合能力和耐用性

湿转 - 详细protocol

最常用的方法，对所有大小的蛋白质都具有出色的转膜效率。最适合大蛋白质（>100 kDa）。

所需材料：

转膜缓冲液（25 mM Tris，192 mM 甘氨酸，20% 甲醇用于 PVDF）
PVDF 或硝酸纤维素膜
滤纸（Whatman 3MM 或等效品）
转膜海绵或垫
转膜夹
带冷却系统的转膜槽
冰或冷包

1
凝胶平衡:电泳后，小心地从板上取下凝胶。在转膜缓冲液中平衡凝胶 15-30 分钟。这可以去除多余的 SDS 并提高转膜效率。在平衡过程中轻轻摇动。
2
膜制备:对于 PVDF：切割至大小，在 100% 甲醇中激活 30 秒，然后在转膜缓冲液中平衡 5 分钟。对于硝酸纤维素：切割至大小并直接在转膜缓冲液中润湿 5 分钟。
3
转膜堆叠组装:在装满转膜缓冲液的托盘中组装转膜堆叠。从阴极（黑色，负极）到阳极（红色，正极）：(1) 海绵，(2) 3 张滤纸，(3) 凝胶（面朝下），(4) 膜（在凝胶顶部），(5) 3 张滤纸，(6) 海绵。通过用试管滚动或使用滚轮去除所有气泡。气泡会阻止该位置的蛋白质转移。
4
转膜条件:将夹子放入装满冷转膜缓冲液的转膜槽中。确保缓冲液覆盖夹子。对于标准转膜：在 4°C 下 100V 1 小时（使用冰或冷却系统）。对于大蛋白质：70-80V 2-3 小时。对于过夜：在 4°C 下 30V 过夜。确保缓冲液在转膜过程中保持冷并充分搅拌。
5
转膜验证:转膜后，通过用 Ponceau S（0.1% 在 5% 乙酸中）染色膜 2-5 分钟来验证效率。用水冲洗以可视化蛋白质条带。这确认了在继续进行封闭之前成功转膜。Ponceau S 可以在封闭前用 TBST 洗掉。

半干转 - 详细protocol

使用最少缓冲液的更快方法。适用于中小型蛋白质（<100 kDa）。对大蛋白质效率较低。

1
缓冲液制备:制备阳极缓冲液：0.3 M Tris，20% 甲醇，pH 10.4。制备阴极缓冲液：25 mM Tris，40 mM 甘氨酸，10% 甲醇，0.01% SDS，pH 9.4。将 3 张滤纸浸泡在每个缓冲液中。
2
在阳极上组装堆叠:在阳极板上：放置 3 张浸泡在阳极缓冲液中的滤纸。将激活的 PVDF 膜放在顶部（或润湿的硝酸纤维素）。通过滚动去除气泡。
3
放置凝胶:小心地将平衡的凝胶放在膜顶部。确保良好接触并通过滚动去除所有气泡。
4
完成堆叠:将 3 张浸泡在阴极缓冲液中的滤纸放在凝胶顶部。去除气泡。关闭转膜装置。
5
转膜:施加恒定电流：每 cm² 凝胶面积 0.8-1.2 mA。对于标准迷你凝胶（8 x 10 cm），使用 15V 30-60 分钟。监控温度 - 半干转膜可能过热。如果温度超过 30°C，使用冷却。

封闭和抗体孵育

适当的封闭和抗体条件对于低背景的特异性检测至关重要。本节提供每个步骤的详细protocol。

封闭 - 详细protocol

封闭防止抗体与膜的非特异性结合，减少背景信号。

Blocking Solutions:

5% 脱脂牛奶 TBST（标准）：

将 5 g 脱脂奶粉溶解在 100 mL TBST 中。充分混合直到溶解。可能需要通过粗棉布过滤以去除未溶解的颗粒。新鲜制备或在 4°C 储存最多 1 周。使用前充分摇动。

Applications: 大多数一般应用，成本效益高，对大多数抗体效果良好

Limitations: 含有酪蛋白，可能干扰磷酸特异性抗体，可能对某些抗体造成高背景

3-5% BSA TBST（用于磷酸化蛋白质）：

将 3-5 g BSA（牛血清白蛋白，Fraction V）溶解在 100 mL TBST 中。轻轻混合以避免起泡。如有必要，通过 0.45 μm 过滤器过滤。在 4°C 储存。在 1 周内使用。

Applications: 磷酸化蛋白质，当牛奶导致高背景时，某些敏感抗体

Advantages: 无酪蛋白干扰，对磷酸抗体的背景较低，更一致

1
制备封闭溶液:新鲜制备封闭溶液或使用储存的溶液（检查有效期）。对于 5% 牛奶：将 5 g 脱脂奶粉溶解在 100 mL TBST 中。通过旋转或轻轻倒置充分混合直到完全溶解（5-10 分钟）。如果仍有颗粒，通过粗棉布或 0.45 μm 过滤器过滤。对于 BSA：将 3-5 g BSA 溶解在 100 mL TBST 中，轻轻混合以避免起泡。如果不立即使用，在 4°C 储存。
2
去除 Ponceau S 染色（可选）:如果您用 Ponceau S 染色验证了转膜，用 TBST 短暂洗涤膜（2-3 次快速冲洗，每次 30 秒）以去除染色。此步骤是可选的 - Ponceau S 可以保留，因为它会在后续洗涤中被去除。排出多余的 TBST 但不要让膜干燥。
3
将膜转移到封闭溶液:将膜蛋白质面朝上放入封闭溶液中。使用足够的体积以完全覆盖膜：迷你凝胶（8 x 10 cm）需要 10-20 mL，较大的膜可能需要 30-50 mL。确保膜自由漂浮并完全浸没。通过轻轻敲击或使用镊子去除任何气泡。
4
轻轻摇动孵育:将容器放在设置为轻柔速度（20-30 rpm）的摇床或振荡器上。在室温（20-25°C）下孵育 1 小时。对于高背景问题，延长至 2 小时或使用更高浓度（10% 牛奶）。或者，如果方便，可以在 4°C 过夜（12-16 小时）进行封闭 - 这可能提高某些应用的封闭效率。
5
进行一抗孵育:封闭后，不要洗涤膜。通过将边缘接触纸巾排出多余的封闭溶液，但不要让膜干燥。立即使用相同类型的封闭溶液（牛奶或 BSA）稀释一抗进行一抗孵育。

Tips:

确保膜完全浸没在封闭溶液中 - 覆盖不足导致高背景
使用轻轻摇动或摇摆（20-30 rpm）- 过于剧烈的摇动可能损坏膜或导致不均匀封闭
如果方便，可以在 4°C 过夜进行封闭 - 这可能提高封闭效率
对于磷酸化蛋白质，始终使用 BSA，不要使用牛奶 - 牛奶含有酪蛋白，会干扰磷酸特异性抗体
尽可能新鲜制备封闭溶液 - 储存的溶液可能失去效果
使用足够的体积 - 膜应该自由漂浮，不粘附容器壁
不要重复使用封闭溶液 - 它可能含有转移的蛋白质或污染物

一抗孵育 - 详细protocol

一抗特异性结合您的目标蛋白质。适当的稀释和孵育条件至关重要。

抗体稀释：

单克隆抗体：通常在封闭液中 1:1000 至 1:5000
多克隆抗体：通常在封闭液中 1:500 至 1:2000
从制造商推荐的稀释度开始，然后通过滴定优化
在封闭液中稀释抗体（与用于封闭的相同溶液）

Optimization: 如果信号弱：增加浓度或延长孵育时间。如果背景高：降低浓度或增加封闭时间。

孵育条件：

在 4°C 过夜（推荐）

最佳信噪比，最敏感的检测。在冷室或冰箱中轻轻摇动或摇摆孵育。

Duration: 12-16 小时

Advantages: 更高的灵敏度，更好的信噪比，方便的时间安排

室温

更快的方法，适用于无法过夜的情况。

Duration: 轻轻摇动 1-2 小时

Advantages: 更快，方便当天获得结果

Limitations: 可能有稍高的背景，不如过夜敏感

Volume: 使用足够的体积以覆盖膜（通常迷你凝胶为 5-10 mL）。如果正确储存在 4°C 并添加防腐剂（0.02% 叠氮化钠），可以重复使用抗体溶液 2-3 次。

1
计算并制备抗体稀释:根据膜大小确定所需体积：迷你凝胶（8 x 10 cm）需要 5-10 mL，较大的膜需要 15-20 mL。计算所需的抗体体积。示例：对于 5 mL 中的 1:1000 稀释，将 5 μL 一抗储备液添加到 5 mL 封闭溶液中。使用微量移液器进行精确体积。通过上下移液或倒置容器 5-10 次轻轻混合。不要涡旋，因为它可能导致起泡或变性。
2
将膜转移到抗体溶液:封闭后，排出多余的封闭溶液（不要让膜干燥）。将膜蛋白质面朝上放入一抗溶液中。确保膜完全覆盖并浸没。对于小膜，使用密封袋（密封前去除气泡）或小容器。对于较大的膜，使用托盘或容器，有足够的溶液完全覆盖。在容器上标记抗体名称、稀释度和日期。
3
在选择的温度下孵育:对于过夜孵育（推荐）：在冷室或冰箱（4°C）中轻轻摇动或摇摆（20-30 rpm）12-16 小时。确保容器密封以防止蒸发。对于室温孵育：在室温（20-25°C）的摇床上轻轻摇动 1-2 小时。监控温度 - 避免过热。过夜孵育通常提供更好的信噪比。
4
保存抗体溶液（可选）:孵育后，可以保存一抗溶液以供重复使用。添加 0.02% 叠氮化钠（每 5 mL 溶液添加 10 μL 10% 叠氮化钠）以防止细菌生长。在密封容器中 4°C 储存。标记抗体名称、稀释度、日期和使用次数。大多数抗体可以重复使用 2-3 次，但每次使用后信号可能减少。如果怀疑污染，丢弃。
5
移除膜并进行洗涤:使用干净的镊子小心地从抗体溶液中移除膜。通过将边缘接触纸巾排出多余的溶液。不要让膜干燥。立即进行洗涤步骤。在此之前不要洗涤膜 - 在一抗孵育前洗涤是不必要的，可能会降低信号。

Tips:

始终在与用于封闭的相同封闭溶液中稀释一抗（牛奶或 BSA）
使用足够的体积 - 体积不足导致结合不均匀和高背景
在 4°C 过夜孵育推荐用于最佳信噪比
如果使用光敏感抗体，保护免受光照
清楚地标记所有容器，包含抗体信息
在过程中任何时候都不要让膜干燥
如果正确储存并添加叠氮化钠，可以重复使用一抗溶液 2-3 次

二抗孵育 - 详细protocol

二抗与检测分子（HRP、荧光染料）结合并结合一抗。

二抗识别并结合一抗，通过其结合酶（HRP）或荧光标签实现检测。适当的选择、稀释和孵育条件对于最佳信噪比至关重要。始终使用物种匹配的二抗（兔一抗用抗兔，鼠一抗用抗鼠），并为每次实验新鲜制备溶液。

二抗选择：

必须对您的一抗物种具有特异性（例如，兔一抗用抗兔，鼠一抗用抗鼠）
使用高度交叉吸附的二抗以最小化交叉反应性
选择适当的结合物：HRP 用于化学发光，荧光染料（IRDye、Alexa Fluor）用于荧光
对于多重检测，使用不同发射波长的二抗

稀释指南：

HRP-conjugated: HRP 结合：在封闭液中 1:5000 至 1:10000

Fluorescent: 荧光标记：遵循制造商的建议，通常 1:5000 至 1:15000

Optimization: 从制造商的建议开始，然后优化。浓度过高会导致高背景。

计算示例：对于 1:5000 稀释，将 1 μL 二抗添加到 5 mL 封闭溶液中。对于 1:10000，将 0.5 μL 添加到 5 mL。使用微量移液器进行精确体积。通过倒置或移液轻轻混合 - 避免涡旋，因为它可能导致起泡。

在封闭溶液中制备稀释（与用于封闭步骤的相同）。根据膜大小计算所需体积：迷你凝胶（8 x 10 cm）需要 5-10 mL，较大的膜可能需要 15-20 mL。始终新鲜制备 - 永远不要重复使用二抗溶液，因为它们会降解并导致高背景。

1
制备二抗溶液:计算所需体积（迷你凝胶 5-10 mL）。将适当体积的封闭溶液添加到干净的容器中。使用微量移液器，添加计算出的二抗储备液体积。对于 5 mL 中的 1:5000 稀释：添加 1 μL 抗体。通过上下移液或倒置容器 5-10 次轻轻混合。不要涡旋。在容器上标记抗体名称、稀释度和日期。
2
将膜转移到抗体溶液:洗涤一抗后，从膜上短暂排出多余的 TBST（不要让干燥）。将膜蛋白质面朝上放入二抗溶液中。确保膜完全浸没。对于小膜，使用密封袋或容器。对于较大的膜，使用托盘或容器，有足够的溶液完全覆盖。通过轻轻敲击或使用镊子去除任何气泡。
3
轻轻摇动孵育:将容器放在设置为轻柔速度（20-30 rpm）的摇床或振荡器上。在室温（20-25°C）下孵育 1 小时。如果使用荧光抗体，用铝箔包裹容器或放在暗盒中以保护免受光照。监控温度 - 避免过热，这会增加背景。不要将孵育时间延长超过 1.5 小时，因为这会在不改善信号的情况下增加背景。
4
移除膜并进行洗涤:孵育后，使用干净的镊子小心地从抗体溶液中移除膜。通过将边缘接触纸巾排出多余的溶液。不要让膜干燥。立即进行洗涤步骤。丢弃二抗溶液 - 不要重复使用，因为它会降解并在后续使用中导致高背景。

Tips:

始终新鲜制备二抗 - 不要重复使用溶液
在孵育期间和之后保护荧光抗体免受光照
使用物种特异性二抗以避免交叉反应性
在室温下孵育 - 4°C 孵育不是必需的，可能会降低信号
确保完全覆盖 - 溶液不足导致染色不均匀
不要不必要地延长孵育时间 - 更长的孵育在不改善信号的情况下增加背景
使用轻柔摇动 - 过于剧烈的摇动可能损坏膜或导致结合不均匀

洗涤 - 详细protocol

彻底洗涤去除未结合的抗体并减少背景信号。

适当的洗涤对于去除未结合的一抗和二抗至关重要，这显著减少背景信号并提高信噪比。洗涤应该彻底但不过度，因为过度洗涤可能减少特异性信号。每次洗涤使用新鲜的 TBST，并确保足够的体积以完全覆盖膜。

所需材料：

TBST（含 0.1% Tween-20 的 Tris 缓冲盐水）
TBS（不含 Tween-20 的 Tris 缓冲盐水）- 用于最终洗涤的可选
洗涤容器或托盘
摇床平台或振荡器
每次洗涤使用新鲜的 TBST（通常迷你凝胶每次洗涤 20-50 mL）

一抗孵育后：

1
第一次洗涤:使用干净的镊子从一抗溶液中移除膜。通过将边缘接触纸巾排出多余的抗体溶液。立即将膜放入新鲜的 TBST（迷你凝胶 20-50 mL）中。确保膜完全浸没。在轻柔速度（20-30 rpm）的摇床上在室温下放置 5 分钟。
2
后续洗涤:完全倒出用过的 TBST。添加新鲜的 TBST（20-50 mL）。继续轻轻摇动洗涤 5 分钟。重复此过程总共 3-5 次（包括第一次洗涤共 4-6 次洗涤）。对于大多数应用，每次 5 分钟，共 4-5 次洗涤是足够的。
3
最终一抗洗涤检查:最终洗涤后，短暂排出多余的 TBST。膜应该准备好进行二抗孵育。在洗涤之间或添加二抗之前不要让膜干燥。

Tips:

每次洗涤始终使用新鲜的 TBST - 重复使用洗涤缓冲液降低效果
确保足够的体积 - 膜应该自由漂浮，不粘附容器
保持轻柔摇动 - 过于剧烈的摇动可能损坏膜
不要不必要地延长洗涤时间 - 每次洗涤 5 分钟是标准

二抗孵育后：

1
初始洗涤:从二抗溶液中移除膜。排出多余的溶液。放入新鲜的 TBST（20-50 mL）中。每次轻轻摇动洗涤 5 分钟，共 3-5 次，在每次洗涤之间更换 TBST。这去除未结合的二抗。
2
高背景的延长洗涤:如果背景高，增加到每次 10 分钟，共 5-7 次洗涤。或者，在 TBST 中添加 0.1% SDS（在 100 mL TBST 中添加 100 μL 10% SDS）进行更严格的洗涤。SDS 有助于去除非特异性结合的抗体。
3
最终冲洗（可选）:对于化学发光检测，用 TBS（不含 Tween-20）进行一次最终快速冲洗（30 秒至 1 分钟）。这去除残留的 Tween-20，它可能干扰某些 ECL 底物。在进行检测前排出多余的 TBS。

Tips:

二抗洗涤更关键 - 未结合的二抗导致高背景
在洗涤过程中监控背景 - 如果 5 次洗涤后仍然高，延长洗涤
对于荧光检测，通常不需要最终 TBS 冲洗
不要过度洗涤 - 过度洗涤可能减少特异性信号

洗涤优化：

如果背景高：

增加洗涤次数：5-7 次而不是 3-5 次
增加洗涤持续时间：每次 10 分钟而不是 5 分钟
在洗涤缓冲液中添加 0.1% SDS：制备含 0.1% SDS 的 TBST（每 100 mL TBST 添加 100 μL 10% SDS）
最终洗涤使用 TBS：用 TBS（不含 Tween-20）代替 TBST 进行最后 2-3 次洗涤
增加洗涤体积：每次洗涤使用 50-100 mL 而不是 20-50 mL
检查抗体浓度：高背景可能表明抗体浓度过高

如果洗涤后信号变弱：

减少洗涤次数：尝试 3 次而不是 5 次
减少洗涤持续时间：尝试每次 3 分钟而不是 5 分钟
检查抗体结合：弱信号可能表明一抗结合不良 - 用阳性对照验证
验证抗体是否被洗掉：某些抗体结合较弱 - 降低洗涤严格性
检查检测试剂：确保 ECL 底物或荧光检测试剂新鲜且工作正常

检测方法

根据您的设备和灵敏度要求选择检测方法。每种方法都有特定的优势和protocol。

化学发光检测 - 详细protocol

最敏感的方法，广泛使用。需要 ECL 底物和 X 光胶片或成像系统。提供出色的灵敏度和动态范围。

1
制备 ECL 底物:根据制造商的说明混合 ECL 底物组分。大多数 ECL 试剂盒有两个组分（鲁米诺和过氧化物），在使用前按 1:1 混合。混合等体积并立即使用。
2
孵育膜:将膜蛋白质面朝上放在干净表面上。将 ECL 底物移液到膜上，确保完全覆盖。在室温下孵育 1-5 分钟。更长的孵育（最多 5 分钟）可能增加信号但也可能增加背景。
3
去除多余底物:通过倾斜膜排出多余底物。不要让膜干燥。用塑料包装包裹或放入成像盒中。确保膜和包装之间没有气泡。
4
图像捕获:对于 X 光胶片：根据信号强度暴露胶片 1 秒至 10 分钟。从短暴露（1-5 秒）开始并调整。根据制造商的说明显影胶片。对于 CCD 相机：放入成像系统并捕获图像。调整暴露时间以避免饱和。
5
多次暴露:在不同时间进行多次暴露，以确保您在线性范围内捕获强和弱条带。记录每个图像的暴露时间。

荧光检测 - 详细protocol

使用荧光标记二抗的定量方法。不需要胶片，允许使用不同颜色的多重检测。

1
二抗选择:使用荧光标记的二抗。常见选项：IRDye 680/800（LI-COR）、Alexa Fluor 488/555/647 或 DyLight 结合物。如果检测多种蛋白质，选择不重叠的波长。
2
孵育:如抗体孵育部分所述，用荧光二抗孵育。在孵育期间和之后保护免受光照以防止光漂白。
3
洗涤:如所述，用 TBST 彻底洗涤。最终洗涤可以用 TBS 以减少背景荧光。
4
扫描:用适合您的荧光团的激光波长扫描膜。对于 IRDye：680 nm 和 800 nm 通道。对于 Alexa Fluor：使用适当的激发波长。调整激光功率和扫描分辨率以获得最佳信号。
5
图像分析:使用成像软件量化条带强度。大多数系统提供内置的量化工具。确保所有条带都在线性检测范围内。

比色检测 - 详细protocol

使用产生有色条带的显色底物的简单方法。不需要特殊设备，但比其他方法灵敏度较低。

1
制备底物:根据制造商的说明制备显色底物。DAB（3,3'-二氨基联苯胺）产生棕色条带。BCIP/NBT 产生紫色/蓝色条带。TMB 产生蓝色条带。
2
孵育膜:将膜放入底物溶液中。在室温下轻轻摇动孵育。条带将在 5-30 分钟内出现，取决于信号强度。
3
停止反应:当条带达到所需强度时，通过用水或停止溶液（如果提供）洗涤来停止反应。对于 DAB，用水停止。对于 BCIP/NBT，当条带可见时用水停止。
4
立即记录:立即通过扫描或拍照记录结果。颜色可能随时间褪色，特别是某些底物。

Western Blot 定量分析

准确的定量需要适当的标准化和分析方法。本节提供量化 western blot 结果的详细protocol。

ImageJ 分析（免费，开源）：

1
在 ImageJ 中打开图像（文件 > 打开）。如果需要，转换为 8 位或 16 位灰度（图像 > 类型 > 8 位）。
2
使用矩形工具在第一个条带周围绘制矩形。转到分析 > 凝胶 > 选择第一条泳道（或按 '1'）。
3
将矩形移动到下一个条带并按 '2' 选择第二条泳道。重复该泳道中的所有条带。
4
选择第一条泳道中的所有条带后，按 '3' 移动到下一条泳道。重复选择过程。
5
选择所有条带后，转到分析 > 凝胶 > 绘制泳道。这创建强度曲线。
6
使用魔棒工具选择峰并测量曲线下面积（积分密度）。
7
记录每个条带的值。如上所述计算比率并标准化。

定量技巧和最佳实践

确保所有样品都在线性检测范围内 - 饱和条带无法准确量化
使用化学发光时对所有样品使用相同的暴露时间 - 不同的暴露使比较无效
包括多个生物学重复（至少 n=3）- 技术重复不够
使用适当的统计分析 - 如果不确定，咨询生物统计学家
记录所有分析参数（暴露时间、软件设置、标准化方法）
验证上样对照适合您的实验条件
考虑使用总蛋白质标准化作为上样对照的替代或补充
注意如果上样对照在条件之间变化，倍数变化可能被低估
对于发表，在补充材料中包含原始图像和定量数据

Western Blot 故障排除指南

Western blot 实验中的常见问题和解决方案。

无信号或弱信号

一抗浓度太低:

增加抗体浓度或延长孵育时间

蛋白质未转移到膜上:

通过用 Ponceau S 染色膜检查转膜效率。优化转膜条件。

抗体对目标不特异:

用阳性和阴性对照验证抗体特异性

检测试剂过期或储存不当:

使用新鲜的检测试剂，根据制造商的说明储存

高背景

封闭不足:

将封闭时间增加到 2 小时或使用更高浓度（10% 牛奶）

抗体浓度太高:

进一步稀释抗体，通过滴定优化

洗涤不足:

增加洗涤次数和持续时间，在洗涤缓冲液中添加 0.1% SDS

膜污染:

使用干净的镊子，避免用裸手触摸膜

非特异性条带

抗体交叉反应性:

使用更特异的抗体或预吸附的二抗

蛋白质降解:

使用新鲜样品，添加蛋白酶抑制剂

不完全变性:

确保样品在 95°C 加热 5 分钟

转膜不完全

大蛋白质（>100 kDa）未转移:

将转膜时间延长至 2-3 小时，将甲醇浓度降低至 10%，在转膜缓冲液中添加 0.1% SDS，或使用较低电压（70-80V）更长时间。考虑使用 0.2 μm 孔径膜。

小蛋白质（<20 kDa）穿过膜:

将转膜时间减少至 30-45 分钟，将甲醇增加至 25%，或使用 0.2 μm 孔径膜代替 0.45 μm。用 Ponceau S 染色验证。

膜上转膜不均匀:

确保凝胶和膜之间良好接触，通过用试管滚动去除所有气泡，检查转膜堆叠是否正确组装，确保转膜过程中缓冲液充分搅拌

实验 protocol 优化策略

系统化优化 western blot protocol以获得最佳结果的方法。一次改变一个参数并记录所有更改。本综合指南提供基于证据的策略，以增强信噪比、提高可重复性并达到发表质量的结果。

样品优化 - 详细指南

优化样品制备以确保最大的蛋白质产量和质量。样品优化是成功 western blotting 的基础 - 样品质量差无法通过后续步骤补偿。

裂解缓冲液选择:

RIPA 缓冲液：最常用，对大多数蛋白质良好，含有洗涤剂（NP-40、脱氧胆酸盐、SDS）用于完全裂解。最适合细胞质和核蛋白质。对某些膜蛋白质可能过于剧烈。
NP-40 缓冲液：较温和，对膜蛋白质和蛋白质复合物良好，变性较少。比 RIPA 更好地保持蛋白质-蛋白质相互作用。
Laemmli 缓冲液：直接裂解，不需要单独的裂解步骤。最快的方法但可能无法有效提取所有蛋白质。
尿素/硫脲缓冲液：用于难以溶解的蛋白质，特别是膜蛋白质。需要仔细调节 pH。
系统化测试不同的缓冲液以找到最适合您蛋白质的

大多数应用从 RIPA 开始。如果信号弱或蛋白质出现降解，测试 NP-40。对于膜蛋白质，首先尝试 NP-40。对于核蛋白质，可能需要更严格的条件或顺序提取。对于磷酸化蛋白质，确保包括磷酸酶抑制剂。

蛋白质浓度:

典型上样：大多数应用每孔 20-50 μg 总蛋白质
对于高表达蛋白质（例如，肌动蛋白、微管蛋白）：10-20 μg 通常足够
对于低丰度蛋白质（例如，转录因子、激酶）：可能需要 50-100 μg
对于极低丰度蛋白质：最多 150 μg，但监控拖尾和伪影
过多的蛋白质（>100 μg）导致拖尾、分辨率差，并可能饱和检测
太少的蛋白质（<10 μg）可能无法检测，特别是对于低丰度目标

从 30 μg 作为基线开始。如果信号弱，增加到 50-75 μg。如果条带拖尾或分辨率差，减少到 20-25 μg。对于定量比较，确保所有样品具有相同的蛋白质浓度。使用 BCA 或 Bradford 测定法进行准确定量 - 不要估计。

样品缓冲液比例:

标准：3 份样品对 1 份 4X 样品缓冲液（最终 1X 浓度）
对于浓缩样品（>10 mg/mL）：可能需要在添加缓冲液之前稀释样品以避免过度浓缩
对于稀释样品（<1 mg/mL）：可能需要在添加缓冲液之前浓缩，或使用 2X 样品缓冲液
确保最终 SDS 浓度足够（0.1-0.2%）以进行适当变性
最终甘油浓度（5-10%）帮助样品沉入孔中

如果条带不清晰或蛋白质出现聚集，增加样品缓冲液比例或确保适当加热。如果样品太粘稠，适当稀释。始终在加热前添加新鲜还原剂（2-ME 或 DTT）。

加热条件:

标准：95°C 5 分钟 - 适用于大多数蛋白质，确保完全变性
替代：70°C 10 分钟 - 较温和，用于在 95°C 下聚集的温度敏感蛋白质
某些蛋白质在高温下可能聚集 - 测试 60°C、70°C、80°C、95°C 以找到最佳温度
对于膜蛋白质：有时 37°C 30 分钟比高温效果更好
永远不要跳过加热 - 不完全变性导致迁移差和伪影

如果您看到多个条带或拖尾表明聚集，测试较低温度。如果条带不清晰或迁移不一致，确保加热完全（检查样品是否实际达到温度）。使用加热块或水浴 - 微波加热不一致。

抑制剂添加:

始终在使用前添加新鲜抑制剂 - 它们会随时间降解
蛋白酶抑制剂：PMSF（1 mM），或商业混合物（遵循制造商说明）
磷酸酶抑制剂：NaF（10-50 mM）、Na3VO4（1-2 mM），或商业混合物
对于磷酸化蛋白质：磷酸酶抑制剂至关重要 - 立即添加到裂解缓冲液
正确储存抑制剂储备液：PMSF 在异丙醇中，Na3VO4 在水中，混合物按推荐储存

如果您看到降解产物（多个较低分子量条带），增加蛋白酶抑制剂浓度或尝试不同抑制剂。如果磷酸化信号弱或不一致，确保磷酸酶抑制剂新鲜且浓度正确。

凝胶优化 - 详细指南

优化凝胶条件以获得最佳蛋白质分离。凝胶优化直接影响分辨率，这决定了您检测特定蛋白质并区分它们与非特异性条带的能力。

适当的凝胶优化确保：(1) 基于分子量的最佳蛋白质分离，(2) 清晰、分辨率良好的条带，(3) 目标蛋白质的适当迁移距离，(4) 最小伪影和拖尾

凝胶百分比:

凝胶百分比决定孔径并直接影响蛋白质迁移。最佳百分比允许您的蛋白质迁移到分离胶的中间三分之一以获得最佳分辨率。

从 10% 凝胶开始（最通用，适用于 30-100 kDa 蛋白质）。对于 <20 kDa 的蛋白质，增加到 15-20% 以获得更好的分离。对于 >100 kDa 的蛋白质，减少到 6-8% 以允许迁移。系统化测试不同百分比：制备 8%、10%、12%、15% 凝胶并在每个上运行相同样品以比较分辨率。

蛋白质 <20 kDa：使用 15-20% 凝胶。较高百分比产生较小孔径，为小蛋白质提供更好的分离。示例：组蛋白、小肽、降解产物。:

蛋白质 <20 kDa：使用 15-20% 凝胶。较高百分比产生较小孔径，为小蛋白质提供更好的分离。示例：组蛋白、小肽、降解产物。

蛋白质 20-100 kDa：使用 10-12% 凝胶。这是最常见的范围。示例：大多数信号蛋白质、转录因子、代谢酶。:

蛋白质 20-100 kDa：使用 10-12% 凝胶。这是最常见的范围。示例：大多数信号蛋白质、转录因子、代谢酶。

蛋白质 >100 kDa：使用 6-8% 凝胶。较低百分比产生较大孔径，允许大蛋白质迁移。示例：受体、大转录因子、结构蛋白质。:

蛋白质 >100 kDa：使用 6-8% 凝胶。较低百分比产生较大孔径，允许大蛋白质迁移。示例：受体、大转录因子、结构蛋白质。

如果蛋白质大小未知：从 10% 开始，或使用梯度凝胶（4-20% 或 8-16%）以获得最佳成功机会。:

如果蛋白质大小未知：从 10% 开始，或使用梯度凝胶（4-20% 或 8-16%）以获得最佳成功机会。

制备 8%、10%、12% 和 15% 凝胶。在每个上加载相同样品。比较：(1) 条带清晰度，(2) 迁移距离（目标应在凝胶的中间三分之一），(3) 与其他条带的分离，(4) 分子量标记的分辨率。选择为目标提供最佳分辨率的百分比。

梯度凝胶:

梯度凝胶在凝胶上提供可变孔径，为跨越宽分子量范围的蛋白质提供更好的分辨率。

在同一凝胶上检测不同大小的多种蛋白质时当蛋白质大小未知或可能变化（例如，剪接变体）时优化新目标蛋白质时对于含有许多蛋白质的复杂样品（例如，全细胞裂解物）

凝胶厚度:

凝胶厚度影响蛋白质容量、分辨率和处理特性。

优化时从 1.0 mm 开始。如果分辨率差且样品有限，尝试 0.75 mm。如果信号弱且可以加载更多，尝试 1.5 mm。

1.0 mm: 标准厚度，良好的分辨率，易于处理，最常用 (标准蛋白质容量（每孔典型 20-50 μg）) - 推荐用于大多数应用，特别是在优化时
1.5 mm: 更多蛋白质容量，如果需要可以加载更多样品 (更高蛋白质容量（如果需要可以加载最多 100 μg）) - 分辨率稍低，较厚的凝胶运行较慢 - 当您需要加载大量蛋白质（低丰度目标）时
0.75 mm: 更高分辨率，运行更快，对小蛋白质更好 (较低蛋白质容量（每孔典型 10-30 μg）) - 更脆弱，更难处理，需要仔细加载 - 用于高分辨率应用、小蛋白质或样品有限时

运行条件:

电压和运行时间影响分离质量、条带清晰度和潜在伪影。

从 100V 恒定电压作为基线开始。如果条带模糊或显示'微笑'（弯曲迁移），降低到 80V 并运行更长时间。如果运行太慢且条带清晰，可以增加到 120V 但密切监控温度。对于大蛋白质（>100 kDa），始终使用较低电压（60-80V）以防止过热并改善转膜。

凝胶制备质量:

凝胶制备的质量直接影响分辨率和可重复性。

常见凝胶问题和解决方案：

条带模糊或拖尾:

Causes: 凝胶运行太快, 过载, 不完全聚合, 温度过高

Solutions: 降低电压，减少蛋白质上样量，确保完全聚合，使用冷却

条带迁移不均匀（微笑效应）:

Causes: 凝胶不水平, 缓冲液水平不均匀, 温度梯度, 凝胶厚度变化

Solutions: 调平凝胶设备，确保缓冲液水平均匀，保持一致温度，检查凝胶厚度

分辨率差:

Causes: 错误的凝胶百分比, 不完全聚合, 运行太快, 凝胶太旧

Solutions: 测试不同的凝胶百分比，确保完全聚合，降低电压，使用新鲜凝胶

转膜优化 - 详细指南