Sample Preparation · 样本制备
Western Blot 样本制备：提取、定量与上样前检查
裂解方法应根据目标蛋白所在组分和需要保留的生物学状态选择。RIPA 适用于部分全细胞提取场景，但膜蛋白、核蛋白、不溶性蛋白或特定分级可能需要其他方法；上胶前还应确认回收率和蛋白定量是否可靠。
本页解决的问题
先排除发生在电泳前的样本问题
弱条带或无条带可能在电泳前就已经产生，例如样本本身不含目标、目标所在组分提取不足、蛋白降解、磷酸化状态丢失、蛋白定量受裂解液干扰，或样本化学导致泳道质量下降。上胶前把这些信息记录清楚，可以减少后续转膜和抗体步骤中的误判。
选择裂解液前先核对样本信息
选择提取方法前先确认以下 4 项信息。
目标所在位置
明确目标主要位于可溶组分、膜、细胞核、细胞器，还是需要单独研究的特定分级。
上清清澈并不能说明目标蛋白已经进入上清。
生物学状态
记录细胞/组织身份、处理条件和采样时间，并确认该时间点是否预期存在目标或目标修饰。
需要保留的状态
常规变性 Western Blot 通常不要求保留天然复合物；研究磷酸化等易变状态时，低温、快速操作和合适抑制剂更重要。
下游兼容性
裂解和蛋白定量方法需要一起考虑。去污剂、还原剂和螯合剂会干扰部分蛋白定量方法。
不同材料的处理重点
不同样本的主要差异如下。
培养细胞
重点检查收样方式、裂解液、目标回收、DNA 黏度，以及目标是否留在被丢弃的不溶性组分。
组织
机械破碎是重要变量；组织异质性、细胞外基质、脂质和匀浆不足都可能影响回收率。
纯化/重组蛋白
纯化目标通常不需要照搬总裂解液的上样量，并可能需要不同的归一化方式。
特殊组分或特殊样本
膜蛋白、核蛋白、胞质、血清、植物、细菌和酵母样本都需要先确认目标所在组分，以及当前提取方法是否适用于该材料。
样本制备流程
1. 收集合适的生物学材料
怎么做
固定处理和采样时间；当降解或修饰状态重要时快速、低温处理。
当场检查
记录样本身份、处理、时间点、起始量和稳定前的延迟。
何时停下来处理
如果阳性样本或生物学状态本身不确定，应先确认样本；增加蛋白量不能补回不存在的目标。
2. 根据目标组分选择提取体系
怎么做
优先采用该目标和材料验证过的裂解液。RIPA 可作为部分全细胞提取的起点，但并不适合所有目标。
当场检查
确认目标理论上应进入当前方法得到的可溶组分；不确定时先保留沉淀。
何时停下来处理
目标属于膜、核或不溶组分，而当前提取方法尚未证明能回收时，应先验证提取。
3. 完成裂解并控制升温
怎么做
根据需要进行机械剪切或超声，使裂解完整并降低黏度。
当场检查
检查未裂解物、DNA 拉丝、起泡、明显升温和异常大的不溶性沉淀。
何时停下来处理
样本仍高度黏稠或明显未充分破碎时，应先解决裂解问题。
4. 澄清时注意目标所在组分
怎么做
按验证方法去除碎屑，但不要默认所有目标都应位于上清。
当场检查
首次优化时，尤其对膜蛋白或不溶性目标，保留或抽检沉淀。
何时停下来处理
如果大部分目标位于通常被丢弃的组分，应调整提取策略。
5. 使用兼容的蛋白定量方法
怎么做
根据去污剂、还原剂、螯合剂和浓度范围选择定量方法，并在工作范围内设置标准和样本稀释。
当场检查
检查空白、标准曲线、重复孔一致性，以及样本稀释后计算浓度是否异常漂移。
何时停下来处理
裂解液与选定方法不兼容或样本超出工作范围时，不应继续使用该浓度值。
6. SDS-PAGE 前统一样本化学组成
怎么做
尽可能让各泳道最终上样液、还原剂和裂解液组成一致。
当场检查
记录每道蛋白量、样本体积和最终缓冲组成。
何时停下来处理
为了等蛋白量而造成各泳道盐或去污剂差异很大时，应先解决样本浓度和体积问题。
建议保留的信息
根据观察决定下一步
先处理最早出现异常或尚未验证的环节。
观察
目标很弱，同时裂解后留下很大的不溶性沉淀
解释
目标回收可能受限。
下一步
比较上清和沉淀，或测试有依据的提取/分级策略。
先不要做
此时不宜先增加抗体浓度或曝光。
观察
同一裂解液稀释后，蛋白浓度计算值明显改变
解释
可能存在基质干扰或测量超出定量范围。
下一步
核对蛋白定量方法的兼容性，在有效范围重测或换用兼容方法。
先不要做
仪器返回浓度值并不代表该数值一定可靠。
观察
随着上样体积增加，泳道越来越拖尾
解释
上样过量和/或盐、去污剂等样本成分可能正在影响电泳。
下一步
保持抗体条件不变，做上样梯度。
先不要做
弱目标不应默认通过持续增加总裂解液解决。
观察
阳性对照目标也没有
解释
样本生物学或制备环节可能在转膜前就已经失败。
下一步
先验证阳性材料和提取，再进入转膜或抗体优化。
先不要做
正常内参不能证明所有目标组分都已成功提取。
相关实验指南
本页主要依据
具体样本、定量试剂盒和裂解产品的说明书优先于本页通用内容。
- Thermo Fisher Scientific — RIPA Lysis and Extraction Buffer
用于核对该 RIPA 配方的提取范围、抑制剂需求和下游兼容性。
- Thermo Fisher Scientific — Protein assay compatibility troubleshooting
用于核对去污剂、还原剂和螯合剂对 BCA、Bradford 等蛋白定量方法的影响。
- Cell Signaling Technology — Western blot troubleshooting
用于核对裂解不完全、样本黏稠和电泳前样本处理问题。
- Cell Signaling Technology — general Western blot sample preparation
用于说明一套经过厂商验证的 direct-SDS 样本制备流程；其中固定体积和时间只适用于对应体系。