按异常现象排查
Western Blot 排错决策树
先根据整膜图、对照和总蛋白转膜图判断异常发生在哪个阶段，再决定下一轮要检查或修改的条件。弱信号并不等于一抗一定太稀。
排错前先核对 5 项信息
- 1.保存未裁切原图，记录曝光、通道以及是否存在像素饱和。
- 2.分别查看分子量 Marker、阳性对照和内参/总蛋白对照。
- 3.调出 Ponceau S 或其他总蛋白转膜图。
- 4.核对一抗和二抗的货号、宿主、批次、稀释液和稀释倍数。
- 5.判断异常影响整张膜、某些泳道、固定膜位置，还是只影响目标蛋白。
先处理最早出现异常证据的实验步骤。增加抗体不能修复转膜失败，延长曝光也不能补回样本中不存在的目标蛋白。
A. 整张膜完全无信号
表现：目标蛋白、内参和阳性对照都没有明确条带。
1. 成像与检测
确认通道、曝光、底物配制和成像仪工作正常。条件允许时，可用已知 HRP 或荧光阳性物检查检测端。
2. 转膜
查看总蛋白转膜图。膜上几乎无蛋白或整体严重不均时，检查夹层方向、气泡、电极、转膜液、电流和散热。
3. 抗体组合
核对一抗宿主、二抗特异性、标记方式和保存状态。不加一抗对照主要用于检查二抗/底物背景，不能单独判断一抗是否失效。
4. 样本与目标
确认阳性样本确实表达目标，并检查预期分子量位置是否包含在原始图像中。
注意：在转膜和检测端尚未确认正常前，不要同时增加一抗、二抗和曝光。
B. 内参正常，但目标蛋白没有或很弱
表现：内参可以检测到，但目标蛋白没有出现预期条带。
1. 目标表达
检查处理时间点、细胞或组织背景、预期表达量和亚细胞定位，并加入验证过的阳性样本。
2. 预期条带位置
核对异构体、信号肽、剪切以及翻译后修饰可能造成的表观分子量变化。
3. 提取与转膜
确认裂解液能够回收目标所在组分，并检查该分子量区域的转膜结果。
4. 一抗条件
回到供应商验证过的样本、稀释液、稀释倍数和孵育方式；需要优化时一次只改变一个条件。
注意：内参正常不能证明膜蛋白或高分子量目标也已经被充分提取和转膜。
C. 整张膜均匀高背景
表现：膜整体发黑，或只有很短曝光时才能看清目标条带。
1. 曝光和底物
采集更短曝光，并检查底物状态、使用体积以及是否可能受到污染。
2. 二抗
核对推荐稀释倍数和物种特异性。二抗过浓是整膜高背景的常见原因之一。
3. 一抗稀释液与封闭条件
按具体一抗说明书选择 milk、BSA 或其他体系；同一种封闭液并不适合所有抗体。
4. 洗膜和操作
使用新鲜洗液、足够体积并充分摇动，孵育和洗膜之间避免膜干燥。
注意：二抗明显过浓时，仅延长封闭或增加封闭蛋白通常不能解决根因。
D. 杂带或分子量不符合预期
表现：预期位置之外反复出现一个或多个条带。
1. 核对可能的生物学形式
检查已知异构体、剪切、糖基化、磷酸化、泛素化和寡聚体。
2. 使用特异性对照
可采用敲除/敲低样本、适当的竞争肽，或识别另一表位的独立抗体。
3. 排除样本和抗体用量因素
降低过高上样量、防止样本降解，并将抗体浓度恢复到产品验证范围。
4. 检查二抗背景
怀疑内源免疫球蛋白或二抗交叉反应时，可加入不加一抗对照。
注意：在核对已知异构体、加工和修饰之前，不宜仅凭分子量把所有额外条带都判为非特异性。
E. 拖尾、泳道很宽或条带变形
表现：信号沿垂直方向扩散，泳道边界不清。
1. 样本质量
检查蛋白降解、反复冻融、澄清不足以及核酸导致的高黏度。
2. 上样量与样本化学
比较更低上样量，并检查盐、去污剂、脂质及其与当前凝胶体系的兼容性。
3. 还原与加热
确认上样液和还原剂状态、混合是否一致，同时考虑目标蛋白是否会在当前加热条件下聚集。
4. 真实异质性
糖基化或高度修饰的蛋白可能形成真实拖尾，需要合适的酶学或遗传学对照进一步判断。
注意：泳道在电泳阶段已经明显变差时，单独调整一抗通常没有帮助。
F. 信号不均匀、斑驳、颗粒状或边缘很深
表现：异常主要固定在膜上某些位置，而不是跟随某个样本。
1. 转膜接触
检查气泡、褶皱、滤纸损坏、夹层压力和转膜液覆盖。
2. 孵育覆盖
使用足够体积并持续摇动，避免膜贴住容器底部或与另一张膜粘在一起。
3. 污染
出现颗粒斑点或疑似微生物污染时，更换可疑缓冲液、容器、镊子和转膜海绵。
4. 成像表面
检查底物积液、膜褶皱、灰尘以及成像仪表面清洁情况。
注意：固定膜位置的异常不应直接解释成不同泳道之间的生物学差异。
异常在转膜前已经出现时
转膜结果异常时
转膜正常时，再检查封闭、抗体和定量
回到完整实验流程
逐步核对起始条件、检查结果和需要调整的情况。
设计下一轮验证实验
固定其他条件，只改变能够区分两个候选原因的变量。
