按现象分诊
Western Blot 排错决策树
不要一上来就改抗体浓度。先给异常分类，保留整膜、对照和转膜染色证据，再定位流程中最早失败的模块。
改变任何参数前，先做 5 分钟分诊
- 1.保存未裁切原图，记录曝光、通道以及是否存在像素饱和。
- 2.分别检查分子量标准、阳性对照和内参/总蛋白对照。
- 3.打开 Ponceau S 或其他总蛋白转膜图。
- 4.核对一抗和二抗的货号、宿主、批次、稀释液和稀释倍数。
- 5.判断异常是全局性的、目标特异性的、泳道特异性的还是位置特异性的。
优先处理流程中最早失败的环节。转膜失败不能靠增加抗体挽救；样本中没有目标蛋白也不能靠延长曝光挽救。
A. 整张膜完全无信号
特征：目标蛋白、内参和阳性对照都没有明确条带。
1. 成像与检测
确认通道、曝光、底物配制和成像仪工作正常。条件允许时使用已知 HRP/荧光阳性物验证检测端。
2. 转膜
查看总蛋白转膜图。若膜上无蛋白或极不均匀，检查夹层方向、气泡、电极、转膜液、电流和散热。
3. 抗体链
核对一抗宿主、二抗特异性、标记方式和保存状态。不加一抗对照不能诊断“一抗失效”。
4. 样本与目标
确认阳性对照确实表达目标，并确认预期条带没有被裁到图像之外。
避免：在证明转膜和检测正常前，不要同时增加一抗、二抗和曝光。
B. 内参正常，但目标蛋白没有或很弱
特征：通用流程大体正常，目标特异性的链路没有产生预期条带。
1. 生物学前提
检查表达量、处理时间点、细胞/组织背景和亚细胞定位，并使用验证过的阳性对照。
2. 预期条带位置
检查异构体、信号肽、剪切以及翻译后修饰导致的表观分子量变化。
3. 提取和转膜
确认裂解液能提取目标所在组分，转膜条件适合该分子量。
4. 一抗条件
回到供应商验证过的样本、稀释液、稀释倍数和孵育方式，然后一次只滴定一个因素。
避免：内参正常并不能证明膜蛋白或超大分子目标一定完成了有效转膜。
C. 整张膜均匀高背景
特征：膜整体发黑，或只有极短曝光时才能勉强看清目标。
1. 曝光和底物
先采集更短曝光，并检查底物是否过期、体积是否合适及有无污染。
2. 二抗
核对推荐稀释倍数和物种特异性。二抗过浓是全局背景常见原因。
3. 稀释液匹配
按一抗说明书选择。奶粉与 BSA 的优劣取决于具体抗体，不存在通用答案。
4. 洗膜和操作
使用新鲜洗液、足够体积和充分摇动，步骤之间不要让膜干燥。
避免：不要在二抗明显过浓的情况下，只是一味增加封闭蛋白。
D. 杂带或分子量不符合预期
特征：预期位置之外出现一个或多个可重复条带。
1. 判断是否为真实生物学形式
检查异构体、剪切、糖基化、磷酸化、泛素化和寡聚体。
2. 使用特异性对照
采用敲除/敲低、适当的竞争肽，或识别另一表位的独立抗体。
3. 减少技术性杂带
降低上样量、防止降解，并把抗体浓度恢复到验证范围。
4. 检查二抗背景
怀疑内源免疫球蛋白或二抗交叉反应时，加入不加一抗对照。
避免：不要在没有检查已知加工和修饰前，把所有偏离分子量的条带都称为非特异性。
E. 拖尾、泳道很宽或条带变形
特征：信号沿垂直方向扩散，泳道边界不清。
1. 样本质量
检查降解、反复冻融、澄清不足以及核酸导致的黏稠。
2. 上样量与化学兼容性
降低上样量；检查盐、去污剂、脂质及其与凝胶体系是否兼容。
3. 还原与加热
确认上样液和还原剂新鲜且混合一致，同时考虑目标特异性聚集。
4. 真实异质性
糖基化或高度修饰的蛋白可形成真实拖尾，需要酶学或遗传学对照验证。
避免：泳道质量问题通常不能通过单纯修改一抗解决。
F. 信号不均匀、斑驳、颗粒状或边缘很深
特征：异常更依赖膜上位置，而不是样本身份。
1. 转膜接触
检查气泡、褶皱、滤纸损坏、夹层压力不足和液体覆盖不全。
2. 孵育覆盖
使用足够液体和摇动，防止膜粘在容器或另一张膜上。
3. 污染
出现颗粒斑点或疑似微生物污染时，更换陈旧缓冲液、容器、镊子和海绵。
4. 成像表面
检查底物积液、膜褶皱、灰尘和成像仪表面清洁度。
避免：不要把位置依赖的伪影解释成不同泳道之间的生物学差异。
回到完整实验流程
逐步核对起始条件、现场证据和调整触发条件。
为下一轮设计最小验证实验
只改变能够区分两个假设的变量。
