从现象到证据
Western Blot 诊断案例库
每个案例从观察现象出发，明确需要什么证据来区分竞争性原因。当前是教学框架，不声称本站完成了对应实验。
案例阅读规则
原因按“需要优先验证”排序，不代表概率已经由真实数据计算。每张配图均为本站原创教学示意图，用于呈现证据关系，不是原始实验数据，也不替代阳性或阴性对照。
案例 1
整膜无信号，且膜上几乎没有总蛋白
观察：目标、内参和阳性对照都没有信号；转膜染色显示各泳道几乎没有蛋白。
转膜失败的证据对比
原创教学示意图，将膜图外观与需要核对的证据放在同一视图中。
需要收集的证据
- • 未裁切整膜图
- • 转膜后胶或总蛋白染色
- • 夹层方向和电极记录
- • 转膜电流/电压记录
优先验证的原因
- 1. 夹层或极性装反
- 2. 电接触不良或转膜液失效
- 3. 大范围气泡或接触不良
下一步区分性动作
保持抗体和检测条件不变，重新转膜，并记录夹层方向和总蛋白染色。
不能仅凭当前现象得出的结论
只有一张空白抗体图，无法区分转膜失败和检测失败。
案例 2
内参正常，但大分子目标蛋白很弱
观察：常规内参条带清晰，但高分子量目标缺失或明显偏弱。
大分子目标转膜不足的证据
原创教学示意图，将膜图外观与需要核对的证据放在同一视图中。
需要收集的证据
- • 验证过的阳性样本
- • 未裁切膜上的目标分子量区域
- • 高分子量区域的转膜染色
- • 条件允许时检查转膜后胶
优先验证的原因
- 1. 大分子目标转膜不足
- 2. 目标所在组分提取不充分
- 3. 表达量低或取样时间不合适
下一步区分性动作
先加入验证过的阳性对照并检查转膜证据，再决定是否调整一抗。
不能仅凭当前现象得出的结论
小分子内参正常不能证明大分子目标一定完成了有效转膜。
案例 3
整体转膜尚可，但小分子目标消失
观察：多数蛋白可以转膜，预期低分子量目标却缺失或重复性差。
小分子蛋白转膜丢失
原创教学示意图，将膜图外观与需要核对的证据放在同一视图中。
需要收集的证据
- • 膜孔径
- • 转膜时间和甲醇浓度
- • 转膜后胶
- • 验证过的小分子阳性对照
优先验证的原因
- 1. 穿膜或膜保留不足
- 2. 目标位于裁图范围之外
- 3. 抗体不兼容或目标丰度过低
下一步区分性动作
保持抗体条件不变，比较更短转膜或 0.2 µm 膜。
不能仅凭当前现象得出的结论
低分子量位置无条带，并不能单独证明发生了穿膜。
案例 4
整张膜均匀发黑
观察：膜整体呈灰黑色，只有很短曝光时才能看清有用条带。
均匀高背景与曝光条件对比
原创教学示意图，将膜图外观与需要核对的证据放在同一视图中。
需要收集的证据
- • 多个曝光时间
- • 二抗稀释和物种
- • 底物配制记录
- • 洗膜体积和时间
优先验证的原因
- 1. 二抗过浓
- 2. 过曝或底物污染
- 3. 洗膜不足或膜曾干燥
下一步区分性动作
保持一抗条件不变，先只改变二抗浓度或曝光中的一个。
不能仅凭当前现象得出的结论
仅凭外观不能证明封闭不足是主要原因。
案例 5
预期位置之外反复出现额外条带
观察：预期条带存在，但多次实验都出现一个或多个额外条带。
额外条带的对照证据
原创教学示意图，将膜图外观与需要核对的证据放在同一视图中。
需要收集的证据
- • 敲除/敲低或已知阴性样本
- • 已知异构体和加工形式
- • 识别另一表位的独立抗体
- • 样本降解记录
优先验证的原因
- 1. 真实异构体、剪切或翻译后修饰
- 2. 一抗交叉反应
- 3. 降解或内源免疫球蛋白信号
下一步区分性动作
先使用遗传阴性对照或正交抗体，再判断额外条带是否为非特异性。
不能仅凭当前现象得出的结论
仅凭分子量不能确定额外条带是生物学现象还是技术伪影。
案例 6
高上样量伴随整道拖尾和泳道变宽
观察：泳道边界不清，信号沿垂直方向扩散，且高浓度样本最明显。
上样量增加与拖尾演变
原创教学示意图，将膜图外观与需要核对的证据放在同一视图中。
需要收集的证据
- • 上样量梯度
- • 裂解液黏度和澄清记录
- • 盐和去污剂组成
- • 冻融历史
优先验证的原因
- 1. 上样过量
- 2. 裂解液黏稠或澄清不足
- 3. 降解或与凝胶体系不兼容
下一步区分性动作
保持抗体条件不变，先重跑一组较低上样量梯度。
不能仅凭当前现象得出的结论
高度修饰蛋白也可能产生真实拖尾，需要结合生物学证据。
案例 7
局部空白区与转膜气泡相符
观察：膜上固定位置出现边界清楚的浅色区域，并横跨相邻泳道。
转膜气泡与位置对应
原创教学示意图，将膜图外观与需要核对的证据放在同一视图中。
需要收集的证据
- • Ponceau 或总蛋白图
- • 夹层照片或组装记录
- • 不同目标是否在同一位置异常
- • 膜和滤纸检查
优先验证的原因
- 1. 胶与膜之间有气泡
- 2. 滤纸折叠或破损
- 3. 夹层压力不均
下一步区分性动作
重新组装并逐层彻底排泡，在抗体孵育前先检查整张膜。
不能仅凭当前现象得出的结论
位置依赖的信号缺失不能解释成样本特异的生物学差异。
案例 8
内参饱和导致错误归一化
观察：各泳道内参都呈同样的纯黑条带，而目标差异看起来很大。
信号饱和与归一化偏差
原创教学示意图，将膜图外观与需要核对的证据放在同一视图中。
需要收集的证据
- • 更短曝光系列
- • 原始像素饱和检查
- • 蛋白上样量梯度
- • 总蛋白归一化图
优先验证的原因
- 1. 内参超出线性范围
- 2. 目标和内参使用了不兼容的曝光条件
- 3. 处理条件下内参并不稳定
下一步区分性动作
调整曝光或上样量，使目标和归一化信号都处于经过验证的线性范围。
不能仅凭当前现象得出的结论
内参看起来同样黑，在饱和情况下并不能证明各泳道上样一致。