SDS-PAGE · 蛋白分离
SDS-PAGE 电泳：凝胶选择、运行与结果判断
转膜前先确认蛋白分离质量。凝胶化学体系、运行缓冲液和电泳参数必须配套；根据 Marker、染料前沿、泳道形态和运行状态判断是否需要调整。
本页解决的问题
转膜前先确认胶内分离质量
凝胶中没有分开的条带，后续 Western Blot 无法重新获得分辨率。本页介绍如何选择凝胶体系和分离范围、控制上样伪影、按具体系统完成电泳，并识别转膜前已经出现的问题。
明确需要分离的分子量区域
先确定目标分子量和需要区分的相邻条带，再选择凝胶体系和分离范围。
1. 明确目标分子量区域
记录目标蛋白的预期表观分子量，以及必须与之区分的最近条带或分子量区域。必要时纳入已知剪切、异构体或异常迁移。
“能看到目标”与“能把两个相近形式分开”对应不同的分离要求。
2. 先选凝胶化学体系，再确定百分比
Tris-glycine、Bis-Tris、Tris-acetate、Tricine 等体系的运行缓冲液和分离行为不能互换。先确定体系，再按该体系的应用指南选择条件。
3. 让孔径范围匹配目标区域
通常聚丙烯酰胺浓度越低，孔径越大，更有利于大分子移动；浓度越高，孔径越小，对小分子筛分更强。需要同时覆盖较宽分子量范围时，可考虑合适的梯度胶。
4. 电压和电流按具体系统设置
采用所用凝胶和电泳槽说明书推荐的运行模式。Bio-Rad 明确指出，过高电压会降低分辨率，并可能造成 smiling 和泳道变形。
不同胶盒尺寸、缓冲体系或设备的电参数不能直接互相照搬。
影响 SDS-PAGE 分离的 4 个关键因素
理解这些因素后，可以根据运行现象判断问题来源，而不必依赖固定的“百分比 + 电压”组合。
Stacking 与 resolving 的作用不同
Laemmli 不连续体系先把样品压缩到较窄的起始带，再按分子大小分离。因此进胶、stacking 区或界面有问题时，泳道可能在进入分离胶前就已经变宽。
凝胶百分比影响筛分强度
聚丙烯酰胺浓度决定孔径大小。低百分比胶孔径较大，高百分比胶孔径较小；合适范围还取决于凝胶化学体系和目标分子量。
梯度胶扩大可用分离范围
梯度胶沿迁移方向逐渐增加筛分强度，可在一张胶上覆盖更宽的分子量范围。若只关注较窄区域，合适的固定浓度胶通常更直接。
运行缓冲液属于凝胶体系的一部分
运行缓冲液影响移动离子边界和电学行为。即使胶百分比合适，使用了不匹配的缓冲液也会改变迁移和分辨率。
电泳过程的 4 个检查点
1. 确认凝胶、缓冲液和电泳槽匹配
怎么做
记录凝胶化学体系、百分比/梯度、胶盒规格、运行缓冲液和电泳槽型号，并严格按该体系要求配制运行液。
当场检查
胶盒安装正确，泳道完整，内外槽液位满足设备要求，没有破坏电路的漏液。
何时停下来处理
凝胶体系与运行缓冲液不匹配、胶盒损坏，或电泳槽无法保持要求液位。
2. 控制上样条件
怎么做
让所有样品最终上样缓冲液组成尽量一致，加入分子量 Marker，并缓慢上样，避免戳破孔底。
当场检查
样品稳定沉到孔底，没有串孔；裂解液不过度黏稠，也没有明显沉淀被强行打入泳道。
何时停下来处理
样品横向扩散、拉丝明显，或者存在肉眼可见沉淀/颗粒。
3. 运行过程中观察前沿和设备状态
怎么做
按具体系统推荐条件运行，同时观察染料前沿、电流/功率、进胶状态和与温度有关的变形。
当场检查
前沿移动较均匀，Marker 与样品按预期进入凝胶，设备状态处于说明书正常范围。
何时停下来处理
前沿明显弯曲、迁移异常快/慢、电流异常、缓冲液明显过热，或泳道开始变形。
4. 转膜前判断分离是否合格
怎么做
在计划终点停止并保存运行记录。必要时用平行胶、牺牲胶总蛋白染色等方式确认目标分子量区域。
当场检查
Marker 覆盖目标区域，泳道形态能够支持后续实验判断。
何时停下来处理
目标区域被挤在一起、小分子已贴近或越过前沿，或者泳道已经拖尾、弯曲。
每次 SDS-PAGE 建议保留的信息
根据泳道形态确定下一步调整
先区分全局运行问题和样品特异问题，再处理最早出现异常的环节。
观察
上样量越高，拖尾和泳道变宽越明显
解释
上样过量、黏度或样品化学组成比抗体问题更可疑。
下一步
保持后续抗体条件不变，先做更低上样量梯度，并检查盐、去污剂、核酸黏度和澄清。
先不要做
不要通过增加一抗或曝光来修复泳道质量。
观察
Marker 和所有泳道一起 smiling 或弯曲
解释
更可能是电场、发热、缓冲液或设备层面的全局问题。
下一步
核对该胶体系的运行缓冲液、液位、厂家推荐功率条件和散热，再重复运行。
先不要做
整张胶都以同样方式变形时，不宜先改胶百分比。
观察
大分子区域挤在胶顶部，小分子区域尚可
解释
当前孔径范围或化学体系可能不适合高分子量区域。
下一步
改用经过该体系验证的低浓度/适当梯度胶，或面向高分子量分离的体系，先比较胶内分离。
先不要做
延长转膜不能修复发生在凝胶里的分离失败。
观察
小分子挤在染料前沿甚至跑出凝胶
解释
低分子量区域筛分不足，或者运行终点超过了需要的分子量窗口。
下一步
选用筛分更强或针对低分子量优化的凝胶体系，并根据目标窗口决定停止时间。
先不要做
确认小分子在胶内能够保留之前，不应直接把无条带归因于转膜穿膜。
观察
只有部分样品泳道变形，而 Marker 很干净
解释
样品特异的盐、去污剂、黏度、还原或上样组成更可疑。
下一步
统一最终样品化学组成，并比较稀释、脱盐或清理后的样品。
先不要做
其他泳道已证明全局运行正常时，先检查样品差异。
相关实验指南
参考资料
以下资料用于说明原理和常见问题；具体电压、电流和运行时间仍以所用凝胶与设备说明书为准。
- Bio-Rad — Performing Protein Electrophoresis
用于核对 SDS-PAGE 装置、上样、系统运行条件，以及功率、样品和缓冲液导致的泳道变形。
- Thermo Fisher — Overview of Electrophoresis
用于核对 SDS-PAGE、聚丙烯酰胺百分比与孔径、不连续体系及梯度胶原理。
- Laemmli, Nature (1970)
经典不连续 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法学来源。