Western Blot 转膜
Western Blot 转膜：方法选择、膜孔径与转膜检查
电泳结束后，可用本页确定转膜方式、膜材料和孔径，并安排转膜后的检查。具体湿转操作、大分子和小分子问题分别有独立专题。
本页解决的问题
转膜结束后先确认蛋白是否到了膜上
目标条带缺失可能有多种原因：蛋白没有充分离开凝胶、穿过膜、没有稳定保留在膜上、局部气泡造成胶膜接触不良，也可能转膜正常而问题发生在后续抗体或检测步骤。封闭前检查总蛋白转膜结果，可以先排除其中一大类问题。
建议起点
电参数和转膜液先按实际设备与膜的说明书执行。不同槽体、cassette 面积和半干转系统的电学条件不能直接互相照搬。
选择转膜方式
根据目标分子量、样本通量、现有设备和厂家验证程序，在 tank/wet、semi-dry 或厂商专用 dry transfer 中选择。难转的大分子需要较长运行时间和持续散热时，wet transfer 通常更便于调整。
选择时主要看目标和设备条件，不单纯比较速度。
确定膜材料与孔径
Nitrocellulose 和 PVDF 都可用于 Western Blot。孔径应与目标分子量相匹配；低分子量蛋白存在穿过大孔径膜的风险时，可考虑 0.2 µm 膜。
组装前核对方向
常规 SDS 变性蛋白带负电，膜应位于胶的 anode/正极一侧，使蛋白从胶迁移到膜。实际组装仍需按具体设备的颜色和极性标记确认。
提前准备转膜检查
准备 Ponceau S 或其他可逆总蛋白染色。怀疑转膜不充分时，先保留转膜后的胶，完成检查后再决定是否丢弃。
三类转膜方式的常见用途
具体表现取决于设备和耗材，下面只说明各方法常见的使用场景。
Tank / wet transfer
胶膜夹层完全浸没在转膜液中，可长时间运行并配合主动散热。对于难转或高分子量目标，通常有较大的条件调整空间。具体操作见 Wet Transfer 页面。
Semi-dry transfer
转膜液主要位于电极板之间的滤纸夹层，速度快、耗液少。运行程序对具体设备和耗材依赖较强，应采用对应系统的厂家程序，不宜直接套用 wet transfer 的电压。
Dry / 厂商专用 transfer
预组装转膜耗材和仪器程序可简化操作，但缓冲体系、电流控制和适用分子量范围由产品本身决定，应以产品说明书为主。
膜材料和孔径
PVDF 机械强度高，NC 使用广泛且易润湿。实际选择还需要结合孔径、目标分子量、转膜液中的 SDS/甲醇以及后续检测方式。
目标分子量会改变转膜条件
判断转膜效果时，应检查目标分子量区域是否已经从胶中迁出，并稳定保留在膜上。
封闭前建议检查
常见结果与处理
先处理最早出现异常的实验步骤。目标分子量区域的转膜已经正常时，就不应继续反复修改转膜条件。
观察
整张膜几乎看不到任何总蛋白
解释
更符合全局转膜故障，而不是单独一支目标抗体的问题。
下一步
核对夹层极性和方向、电接触、转膜液配制、cassette 组装和设备运行，再决定是否重做。
先不要做
不要先增加一抗或二抗浓度。
观察
相邻泳道同一位置出现边界清楚的局部空白
解释
气泡、折叠或局部接触不良较可疑。
下一步
在总蛋白图上确认位置是否对应；重做时逐层排泡并保证胶膜平整接触。
先不要做
固定膜位置的异常不应解释成不同样本的生物学差异。
观察
高分子量蛋白在转膜后胶中仍明显残留
解释
该分子量区域转膜不充分。
下一步
进入 Transfer Optimization 和 Large Proteins 页面，逐项评估时间/电场、散热、凝胶孔径、甲醇和小幅 SDS 调整。
先不要做
小分子内参很强不能证明大分子目标也已经转好。
观察
整体转膜尚可，但很小的目标蛋白缺失
解释
可能发生穿膜或膜上保留不足，但抗体问题和低丰度仍需排除。
下一步
检查膜孔径和转膜时长；必要时用第二张膜或已验证的小分子阳性样本进一步判断。
先不要做
不能只凭抗体图就认定发生了过度转膜。
观察
目标分子量区域的总蛋白转膜正常，但目标抗体仍无信号
解释
现有结果不支持继续把转膜作为首要问题。
下一步
检查目标表达、样本提取、预期表观分子量和抗体验证。
先不要做
不要仅因为目标抗体无条带就不断延长转膜。
相关转膜专题
主要参考来源
具体设备和膜的产品说明优先于下面的通用资料。厂商支持页面给出的数值主要适用于其对应系统，使用前应结合自己的设备和样本验证。
- Bio-Rad — Separating Proteins to a Blotting Membrane
用于核对转膜方向、wet 与 semi-dry 的适用场景、膜预处理、排泡、目标分子量影响和转膜确认。
- Thermo Fisher Scientific — Western Blotting Support: Troubleshooting
用于核对大分子残留、小分子穿膜、缓冲液组成和异常电流等转膜问题。
- Towbin, Staehelin & Gordon (1979) — Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets
经典电转方法学来源，描述从聚丙烯酰胺胶向硝酸纤维素膜电泳转移蛋白的方法。