Sample Preparation · 上样量
Western Blot 上样量：用上样梯度确定可用范围
可用上样量取决于目标丰度、样本复杂度、抗体和检测灵敏度、凝胶容量，以及定量实验中目标和归一化信号的响应范围。不同目标和检测体系不能共用一个固定微克数。
本页解决的问题
过高上样量会造成泳道变形和信号饱和
增加裂解液可能使弱条带更明显，但也会造成凝胶过载、迁移畸变、目标或内参饱和，并把更多盐和去污剂等基质一起带入泳道。合适的上样量应通过梯度实验确定。
设计上样梯度预实验
可先用代表性样本做上样梯度，确定泳道质量和信号的工作范围。
使用同一代表性裂解液
在主实验前，用一份具有代表性的样本制作泳道输入梯度。
保持化学组成可比
降低蛋白量时，不应同时让盐、去污剂、还原剂和上样液浓度发生很大变化。
同时检测目标和归一化信号
目标与内参/总蛋白应在同一段上样范围内都能够可靠测量。
保留未裁切和未饱和图像
检查泳道形态、饱和和完整信号范围，不应仅根据裁切后的单个条带选择上样量。
可用上样量的主要限制
凝胶容量、目标信号和归一化信号中最先失去可用性的条件决定上限。
凝胶/泳道容量
在抗体孵育之前，过载就可能造成条带变宽、整道拖尾和迁移变形。
目标检测范围
当目标信号进入平台期后，信号不再按样本量成比例增加。
归一化范围
饱和的内参无法校正上样差异；定量时目标和归一化信号需要存在共同可用范围。
样本基质
增加裂解液还会同时增加盐、去污剂、脂质等成分，可能影响电泳分离。
用实验确定上样量
1. 制备上样梯度
怎么做
设置数个泳道输入，覆盖当前使用量的上下范围。
当场检查
最终上样液和还原条件尽量一致。
何时停下来处理
如果梯度同时造成很大的样本化学变化，应重新设计稀释方式。
2. 跑 SDS-PAGE 并检查泳道质量
怎么做
使用主实验计划采用的同一凝胶体系。
当场检查
检查宽泳道、整道拖尾、压缩、Marker 迁移异常等过载迹象。
何时停下来处理
分离质量开始恶化时，不再继续增加上样量。
3. 固定转膜、抗体和成像条件
怎么做
上样梯度之间保持后续条件一致。
当场检查
采集未饱和曝光并保留原始图。
何时停下来处理
条带饱和或不同泳道使用不同曝光时，无法判断响应范围。
4. 确定目标信号响应范围
怎么做
评估目标信号随样本输入增加的关系。
当场检查
在用于比较的区间内，信号应随样本量保持足够的比例关系。
何时停下来处理
进入平台期后，不应继续把更高上样量用于定量比较。
5. 确定归一化信号响应范围
怎么做
在同一梯度上评估内参或总蛋白信号。
当场检查
找到目标和归一化方法同时可用的重叠区间。
何时停下来处理
没有重叠区间时，应改变上样范围或归一化策略。
6. 在共同范围内部选择工作点
怎么做
结合预期上调和下调幅度，选择留有余量的泳道输入。
当场检查
预期生物学变化后，目标和归一化信号仍应尽量位于可用范围。
何时停下来处理
接近饱和的上样量不应因为条带更黑而被选作工作点。
确定上样量时应保留的信息
根据观察调整上样量
弱信号、过载和饱和需要分别处理。
观察
随上样量增加，目标信号增加且泳道仍清晰
解释
当前范围可能仍然可用。
下一步
继续到足以定义上界，并同时检查归一化范围。
先不要做
不应自动选择条带最黑的泳道。
观察
信号不再增加，但条带更黑或更宽
解释
可能已经出现检测饱和和/或凝胶过载。
下一步
回到更低上样区间，并根据需要调整曝光。
先不要做
平台期信号不能按成比例数据进行定量。
观察
目标仍在线性范围，但内参已经饱和
解释
当前上样量下，归一化方法失效。
下一步
降低上样量、换经过验证的内参，或评估总蛋白归一化。
先不要做
同样黑的内参条带不能证明上样量相同。
观察
只有在严重拖尾的高上样量下才看得到目标
解释
继续增加总裂解液会以牺牲泳道质量为代价。
下一步
分别评估提取、富集、抗体/检测灵敏度或凝胶兼容性。
先不要做
已经明显过载的泳道不应继续增加总蛋白。
相关实验指南
本页主要依据
上样量应以目标和归一化信号共同可用的实测范围为依据，而不是固定的泳道蛋白质量。
- LI-COR — Quantitative Western Blot: target and internal loading-control linear range
用于核对目标和内参共同线性区间以及通过样本梯度选择工作点。
- Bio-Rad — Total Protein Normalization
用于核对定量 Western 需要样本量与信号成比例，并处于成像线性范围。
- Thermo Fisher Scientific — Protein assay compatibility troubleshooting
用于确保上样量计算建立在与裂解基质兼容的蛋白浓度测量上。