样本制备 · 上样量
Western Blot 上样量：用上样梯度确定可用范围
可用上样量取决于目标丰度、样本复杂度、抗体和检测灵敏度、凝胶容量，以及定量实验中目标和归一化信号的响应范围。不同目标和检测体系不能共用一个固定微克数。
先区分总裂解液与纯化蛋白
“每孔多少蛋白”需要先说明测量对象。总裂解液的 µg 不能直接当作目标蛋白的 µg，也不能把一套裂解液条件直接用于纯化蛋白阳性对照。下面的区别决定浓度如何解释，以及应该建立哪种上样梯度。
| 样本 | 质量代表什么 | 上样前确认 |
|---|---|---|
| 细胞或组织总裂解液 | 总蛋白质量；目标蛋白只占其中一部分。 | 用兼容的定量方法测总浓度，再以目标与归一化信号共同可用的上样梯度选量。 |
| 纯化或重组蛋白 | 储液蛋白质量；是否等于目标质量还取决于纯度与浓度标定。 | 记录构建体、标签、纯度、储液基质和浓度单位；用该抗体与检测体系建立独立梯度。 |
| 直接 SDS 制样或未定量样本 | 已记录的样本输入、制备体积和上样体积。 | 不要直接套用不兼容的浓度测定；如需按质量上样，先验证定量方法与当前缓冲液兼容。 |
单位练习：50 ng 不是 50 µg
以下数字只用于演示单位与移液，不是推荐上样量。假设一份纯化蛋白储液浓度为 0.2 mg/mL，希望在教学算例中加入 50 ng 的储液蛋白。纯度、抗体灵敏度、泳道容量与可检测范围仍需要独立确认。
0.2 mg/mL = 0.2 µg/µL = 200 ng/µL
50 ng ÷ 200 ng/µL = 0.25 µL
如配制已记录的 1:10 中间液：200 ÷ 10 = 20 ng/µL
50 ng ÷ 20 ng/µL = 2.5 µL
若 0.25 µL 低于移液器可靠范围，可先评估兼容的中间稀释方案。例如 10 µL 储液 + 90 µL 兼容稀释液可配成 100 µL 的 1:10 中间液；取 2.5 µL，其中含 50 ng 储液蛋白。这个算例不证明稀释后的稳定性、吸附损失或抗体能检出 50 ng。
误把 50 ng 填成 50 µg，理论储液取量会从 0.25 µL 变成 250 µL，相差 1,000 倍。工具采用 µg 时，50 ng 应先换成 0.05 µg；中间液为 0.02 µg/µL。最终配样还需计入上样液和其他组分，不能仅凭样本体积判断配方可容纳。
纯化蛋白可帮助核对抗体与检测链路，但其浓度、基质和表位状态与内源性裂解液不同。阳性对照出现条带不能单独证明裂解液目标身份、提取回收率或定量线性。下方模拟梯度明确针对总裂解液，应使用自己的样本和测量值重新建立。
计算练习
上样梯度示例：确定可用范围
1. 先算每个泳道的混合体积
假设同一批裂解液经兼容的蛋白定量方法测得 2 µg/µL，每泳道最终体积固定为 30 µL，使用 4× 上样缓冲液。这里的 5、10、20、40 µg 是为了覆盖低信号到过载区间而构造的教学梯度，不是推荐给所有样本的上样量。先核实泳道容量、试剂配方以及研究对象允许的加热条件。
裂解液体积 = 蛋白质量 ÷ 浓度
4× 缓冲液体积 = 最终体积 ÷ 4 = 7.5 µL
稀释液体积 = 30 − 裂解液体积 − 7.5 µL
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| 蛋白（µg） | 裂解液（µL） | 4× 缓冲液（µL） | 稀释液/水（µL） | 总量（µL） |
|---|---|---|---|---|
| 5 | 2.5 | 7.5 | 20.0 | 30 |
| 10 | 5.0 | 7.5 | 17.5 | 30 |
| 20 | 10.0 | 7.5 | 12.5 | 30 |
| 40 | 20.0 | 7.5 | 2.5 | 30 |
20 µg 一泳道需要 10 µL 裂解液 + 7.5 µL 4× 缓冲液 + 12.5 µL 稀释液。最终上样缓冲液均为 1×。此处“水”只表示已验证可用的稀释液算例：如果盐或去垢剂影响检测，应使用兼容的匹配裂解缓冲液，并记录其组成，避免把上样质量和样本基质同时改变。还原剂若需另加，应计入最终体积；本表假定其已在上样缓冲液中。
本配方最多容纳 45 µg：超过后稀释液体积为负，不能直接照表操作，应先浓缩样本或重新设计体积。这个算术上限不等于泳道容量或定量上限。移液量低于器具可靠区间时，先做已知倍数的预稀释，再重新计算。
2. 看比例响应，而不是挑最黑的一条
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| 上样（µg） | 靶标 | 内参 | 总蛋白 | 靶标/µg | 内参/µg | 判断 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 5 | 5,000 | 10,000 | 3,000 | 1,000 | 2,000 | 候选区间；需追加验证 |
| 10 | 10,000 | 20,000 | 6,000 | 1,000 | 2,000 | 候选区间；需追加验证 |
| 20 | 20,000 | 32,000 | 12,000 | 1,000 | 1,600 | 内参偏离比例 |
| 40 | 34,000 | 34,000 | 24,000 | 850 | 850 | 截顶，排除定量 |
5→10 µg 时，两通道均翻倍。10→20 µg 时靶标翻倍，内参却只变为 1.6 倍；因此不能凭靶标线性就接受 20 µg 的管家蛋白归一化。40 µg 的靶标预期应为 40,000，实际只有 34,000，为预期的 85%；两个通道又有截顶标记，不能进入定量。
对全部四个靶标点做带截距的线性回归，R² 仍为 0.991。它描述拟合程度，不会撤销饱和或证明比例响应。检查每微克响应、相邻倍比、残差、重复间波动和图像的截顶信息，比寻找一个漂亮 R² 更有意义。
下一轮可在候选区间加入更多点，并重复测量，例如围绕 5–10 µg 细分梯度，重新确认目标与参照的共同响应。接受误差应根据用途和实测变异预先设定。本例总蛋白信号一直成比例，只能展示另一种可能的参照策略；它不能修复 40 µg 已经饱和的靶标。选择上样量时还应验证最强信号的实验组，而不只验证对照裂解液。
下载 CSV：混合体积与响应数据方法参考资料
- LI-COR — TPS + Targets Linear Range Workflow
支持分别检测靶标与总蛋白参照，并确定二者共同适用的上样区间；不代表本页模拟数据已获实验验证。
- ImageJ — Analyze / Set Measurements
将 RawIntDen 定义为像素值之和，将 IntDen 定义为 Area × Mean。未标定图像中二者相同；使用标定面积或强度时必须统一单位。
- Bio-Rad — Total Protein Normalization
介绍以整泳道总蛋白作为参照的技术方法。仍需确认染色兼容性、未饱和的响应区间和合理的归一化问题。
记录结果与相关指南
保存实验条件、原始图像和结果判断。下方提供记录单，以及制样、上样、转膜和定量的相关指南。