SDS-PAGE · 凝胶选择与制备
SDS-PAGE 凝胶制备：凝胶选择、灌胶与质量检查
制胶前先根据目标分子量确定化学体系和孔径范围，再采用经过验证的厂家或实验室配方。上样前还需检查聚合、界面、泳道和凝胶完整性。
本页解决的问题
确定需要哪种凝胶，并检查是否可以上样
凝胶制备包含三个相互关联的问题：化学体系、分离范围和实际制胶质量。本页比较固定胶与梯度胶、预制胶与手灌胶，并列出上样前需要完成的质量检查。
根据目标分子量选择凝胶
胶盒上的百分比必须结合凝胶化学体系和目标分子量区域理解。
只关注窄区域，还是需要覆盖宽范围？
合适的固定浓度胶可以把分辨率集中在较窄的分子量区域；需要一张胶同时覆盖大跨度蛋白时，梯度胶通常更合适。
根据分子量范围选择化学体系
Tris-glycine 使用广泛；厂家体系还包括覆盖较宽范围的 Bis-Tris、用于高分子量分离的 Tris-acetate，以及改善低分子量分辨率的 Tricine 等。选择时查看具体产品/体系的分离图。
一种化学体系的百分比范围不能直接换算到另一种体系。
预制胶还是手灌胶？
预制胶可以减少灌胶变异，产品和批次也更容易记录；手灌胶允许自定义浓度和规格，但同时引入聚合、界面、泳道和批间差异。
手灌胶采用经过验证的配方
按照实际使用的丙烯酰胺母液、交联比例、缓冲体系、总体积和胶盒规格执行配方。装置准备完成后再按规定加入聚合引发剂，并遵守未聚合丙烯酰胺相关 SDS 和实验室安全要求。
不同凝胶设计对分离的影响
固定浓度胶
整张分离胶采用同一孔径范围。目标区域明确，且该化学体系能提供足够分离时，可以优先采用。
梯度胶
沿迁移方向孔径逐渐减小，可扩大单张胶的有效分离范围，并使蛋白进入更强筛分区域后进一步收窄。
Stacking 区
在 Laemmli 类不连续体系中，stacking 区先把样品压缩成较窄起始带。孔底破损、stacking 失败或界面不平，都可能让样品过早变宽。
Resolving 区
按分子大小的主要分离发生在这里。化学体系、丙烯酰胺浓度/梯度和运行缓冲液需要配套使用。
手灌胶的 4 个质量检查点
1. 加聚合剂前准备好胶板和配方
怎么做
清洁并组装胶板/Spacer，确认密封，按实际胶盒体积计算经过验证的配方，并标记体系和计划百分比/梯度。
当场检查
胶板水平、不漏液，试剂身份和浓度与当前配方版本完全对应。
何时停下来处理
胶板漏液、丙烯酰胺母液/交联比例不确定，或缓冲液/pH 属于另一套体系。
2. 灌 resolving 区并形成平整界面
怎么做
按照验证配方配制 resolving 溶液，在规定步骤加入聚合引发剂，轻柔混合、避免引入气泡并立即灌胶。
当场检查
聚合行为符合该配方预期，上表面足够平整，可支持均匀 stacking 层。
何时停下来处理
凝胶长期软/液态，样品路径中有大气泡、胶体脱离玻璃，或界面明显倾斜/不规则。
3. 灌 stacking 区并形成完整泳道
怎么做
按配方要求移除/冲洗 overlay，灌 stacking 溶液，插梳时避免在梳齿末端困住气泡。
当场检查
Stacking 区完成聚合，拔梳后孔底不撕裂、泳道不连通，也没有明显未聚合材料。
何时停下来处理
泳道破损、相连、充满气泡，或不同泳道深度明显不一致。
4. 按体系要求记录和保存
怎么做
记录制胶日期、配方/批次及所有偏离。立即使用，或只按该凝胶化学体系已经验证的条件保存。
当场检查
上样前凝胶保持水合、完整，没有明显裂纹、收缩、污染或泳道损伤。
何时停下来处理
保存历史不清楚，或凝胶物理状态已经改变到无法信任迁移结果。
上样前应确认的凝胶信息
制胶缺陷与处理方式
凝胶本身不合格时，应先换胶或重新制备，不应依赖后续电泳、转膜或抗体条件弥补。
观察
手灌胶没有按预期聚合
解释
聚合剂活性、氧暴露、试剂身份/浓度、缓冲体系或配方执行存在问题。
下一步
废弃失败凝胶，重新核对配方和新鲜聚合试剂，记录批次/条件后重做。
先不要做
不要把珍贵样品上到半聚合凝胶中。
观察
气泡、裂缝或倾斜界面穿过目标泳道
解释
物理迁移路径会产生位置依赖的迁移伪影。
下一步
在上实验样品前重新灌胶或换胶。
先不要做
后期图像分析无法可靠修复制胶造成的迁移缺陷。
观察
实验核心是高分子量蛋白
解释
过紧的高浓度胶可能在目标区域提供过强筛分。
下一步
根据厂家分离图选择低浓度/适当梯度，或经过验证的高分子量专用体系。
先不要做
不同化学体系中的“低百分比”不能视为等价条件。
观察
必须把低分子量目标与附近小条带分开
解释
需要更强的低分子量筛分，可考虑更高百分比或经过验证的 Tricine 等低分子量优化体系。
下一步
按产品/体系分离范围选胶，并设计停止点，避免小分子跑出。
先不要做
适合较大内参蛋白的凝胶未必适合低分子量目标。
观察
不同批次手灌胶表现持续波动
解释
灌胶或聚合已经成为主要实验变异来源。
下一步
标准化配制、计时和验收；若重复性比自定义更重要，可比较合适的预制胶体系。
先不要做
凝胶本身持续变化时，不能把所有迁移差异都归因于样品生物学。
相关 SDS-PAGE 指南
参考资料
以下资料用于理解原理和体系选择。手灌胶的试剂体积与聚合条件应来自实际采用的验证配方。
- Thermo Fisher — Overview of Electrophoresis
用于核对聚丙烯酰胺孔径、固定浓度/梯度胶、不连续 SDS-PAGE 和代表性缓冲体系。
- Thermo Fisher — Precast Protein Gels
用于比较 Bis-Tris、Tris-glycine、Tris-acetate、Tricine 等体系及其适用范围。
- Laemmli, Nature (1970)
经典不连续 SDS-PAGE 方法学来源。