Western Blot 完整流程：从样本制备到成像定量

建议起点

研究易降解蛋白或磷酸化等易变修饰时，应尽量低温、快速处理。根据目标蛋白所在组分选择裂解方法，并按已验证流程加入蛋白酶或磷酸酶抑制剂。

需要调整时

膜蛋白、核蛋白、不溶性蛋白或目标回收率偏低时，应调整裂解体系或考虑组分分离。单纯增加上样量不能解决提取不足。

建议起点

按计划的蛋白量配样，尽量让各泳道最终盐、去污剂、上样液和还原剂组成接近，并采用目标蛋白和凝胶体系可接受的加热条件。

需要调整时

上样量没有经过验证时，可先做上样梯度。若某些目标在强烈加热后聚集，只在有明确依据时比较替代加热条件。

建议起点

根据目标分子量和需要分开的邻近条带选择凝胶体系、浓度或梯度胶，并控制上样量，保证泳道不过载，同时加入分子量 Marker。

需要调整时

凝胶分离范围应以具体产品或体系说明为准。出现明显 smiling、泳道变形或整道拖尾时，先解决电泳问题再进入转膜和抗体优化。

建议起点

组装胶膜夹层时排净气泡。NC 膜按说明直接在水或转膜液中润湿；PVDF 按膜供应商要求预润湿。电参数优先遵循具体转膜设备说明书。

需要调整时

大分子蛋白常需要更充分的转膜时间和散热，有些体系还会调整甲醇；小分子蛋白则要警惕穿膜，可比较更短转膜或 0.2 µm 膜。调整方向应由转膜结果决定。

建议起点

奶粉或 BSA 都可用于部分 Western Blot 体系。具体抗体如果给出了验证过的封闭液或一抗稀释液，应优先照产品说明执行。

需要调整时

信号或特异性不佳时，先核对供应商推荐的稀释液，再调整抗体浓度。封闭剂、抗体浓度和洗膜条件尽量不要在同一轮同时改变。

建议起点

从供应商验证过的稀释倍数、稀释液和孵育条件开始；产品对时间和温度有明确要求时按说明执行。

需要调整时

确认目标表达、转膜和检测均无明显问题后，再围绕已验证条件做小范围滴定。增加一抗可能提高背景，不能补回样本中不存在的目标。

建议起点

使用新鲜洗液、足够体积并充分摇动。二抗需匹配一抗宿主和所用检测系统。

需要调整时

整张膜均匀发黑时，优先检查二抗浓度、曝光、污染和洗膜，再判断是否需要修改一抗条件。

建议起点

使用状态正常的底物或正确的荧光采集设置，采集足够的曝光以识别饱和，并保存未裁切原始数据。

需要调整时

目标或归一化信号超出可用范围时，应调整样本量、抗体或采集条件后重新测量。饱和条带不宜直接用于定量，也不能靠后期调图恢复线性。