样本制备 · 培养细胞
Western Blot 细胞裂解液制备：确认目标蛋白回收
培养细胞裂解是否合格，应根据目标蛋白回收、蛋白定量兼容性和后续 SDS-PAGE 表现判断。收样后还需注意目标是否留在不溶性沉淀中，以及 DNA 黏度是否影响移液和上样。
实验台手册 · 样本制备
Western blot 细胞裂解与样本准备
需要可溶组分并测定蛋白浓度时，可选 RIPA 提取；需要直接在上样液中制样时，可选 SDS 裂解。下面分别按 Thermo Scientific Pierce RIPA 89900/89901 和 CST 说明列出步骤。
步骤旁的来源标记可跳转到本页末尾的厂商流程与说明书。
本页解决什么问题
RIPA 方法使用 Thermo 89900/89901，适用于培养哺乳动物细胞。说明书给出 HeLa 和 A431 的用量；其他细胞系可从此起步，再检查提取产量。
CST 分支是 6 孔板或 10 cm 皿的直接变性上样流程，适用于不需要先得到可溶蛋白浓度的场景，但不能与澄清后的 RIPA 上清等同。
本页在已标记的澄清上清或热处理 SDS 样本处停止；定量、上胶和转膜见完整流程和湿转手册。
材料与记录
冷 PBS[THERMO-89900]
Thermo 贴壁和悬浮流程都要求用冷 PBS 清洗两次。
Thermo Pierce RIPA 89900/89901[THERMO-89900]
25 mM Tris-HCl pH 7.6、150 mM NaCl、1% NP-40、1% 脱氧胆酸钠、0.1% SDS；到货后 4 °C 保存。
蛋白酶/磷酸酶抑制剂[THERMO-89900]
RIPA 不自带；需要保留蛋白或磷酸化状态时，在使用前立即加入兼容抑制剂。
CST 1× 还原 SDS sample buffer[CST-WB]
CST #7722/#7723：1 体积 3× SDS buffer 加 1/10 体积 30× DTT，再用水稀释至 1×。直接裂解为 6 孔板每孔 100 µL 或 10 cm 皿 500 µL。
细胞刮刀、微量管、冰和离心机[THERMO-89900]
目标分区不确定时，保留沉淀并分别标记。
BCA 兼容定量[THERMO-FAQ]
Thermo 列出 Pierce BCA 兼容；产品 FAQ 说明 RIPA 会产生强 A280 信号，影响浓度和纯度比值。
来源说明的起始数字
窄屏可左右滚动查看完整参数表。
| 参数 | 起始条件 | 使用说明 |
|---|---|---|
| RIPA 配方 | 25 mM Tris-HCl pH 7.6；150 mM NaCl；1% NP-40；1% 脱氧胆酸钠；0.1% SDS[THERMO-89900] | 使用 89900/89901 的公开配方；不能仅凭“RIPA”名称推断商业产品相同。 |
| 贴壁比例 | 每 75 cm² 培养瓶、5 × 10⁶ HeLa 或 A431 用 1 mL 冷 RIPA；冰上 5 分钟[THERMO-89900] | 这是 Thermo 对指定细胞的起始条件。 |
| 贴壁澄清 | 约 14,000 × g 15 分钟[THERMO-89900] | 把上清转到新管；来源流程把沉淀视作碎屑。 |
| 悬浮细胞比例 | 每 40 mg 湿沉淀（约 5 × 10⁶ HeLa）用 1 mL RIPA[THERMO-89900] | 湿沉淀质量是来源条件的一部分。 |
| 悬浮细胞收集 | 2,500 × g 5 分钟，PBS 清洗两次；裂解后冰上轻摇 15 分钟[THERMO-89900] | 记录收集离心与裂解澄清离心，不要混成一个参数。 |
| 直接 SDS 分支 | 6 孔板每孔 100 µL 或 10 cm 皿 500 µL；超声 10–15 秒；95–100 °C 5 分钟[CST-WB] | 这些数值来自 CST，不是 RIPA 替代值。 |
预计用时与检查要点
收样前
预冷 PBS/RIPA，标记组分，使用前立即加兼容抑制剂。
已记录裂解方法和加入的抑制剂。
贴壁 RIPA
冷洗两次 → 冰上 5 分钟 → 刮取 → 约 14,000 × g 15 分钟。
上清和沉淀分开标记。
悬浮 RIPA
2,500 × g 5 分钟收集/清洗 → 冰上 15 分钟 → 约 14,000 × g 15 分钟。
比例对应湿沉淀或细胞估计。
直接 SDS
清洗 → 在 1× SDS 刮取 → 超声 10–15 秒 → 加热 5 分钟 → 冷却 → 离心 5 分钟。
记录体积并保持分支独立。
RIPA 与直接 SDS 制样步骤
RIPA 与直接 SDS 制样应分开。两者的去污剂会影响蛋白定量、黏度和回收组分，因此每个样本都要注明所用缓冲液。
1 · 选择裂解方法
需要可溶且可定量提取物时选 Thermo RIPA；需要培养皿直接变性上样时选 CST SDS。膜、核或不溶性目标不确定时保留沉淀并写出组分保留计划。
当场检查：裂解前记录表已写明一个分支和一个样本组分。
2A · Thermo RIPA 贴壁细胞[THERMO-89900]
倒去培养基，冷 PBS 清洗两次。每 75 cm²、5 × 10⁶ HeLa 或 A431 加 1 mL 冷 RIPA，轻晃铺匀，冰上 5 分钟。刮取、收集，约 14,000 × g 15 分钟。
当场检查：上清与碎屑沉淀分开；抑制剂及加入时间已记录。
2B · Thermo RIPA 悬浮细胞[THERMO-89900]
2,500 × g 5 分钟收细胞；冷 PBS 清洗两次，并重复 2,500 × g 5 分钟收集。每 40 mg 湿沉淀加入 1 mL RIPA，吹打悬匀，冰上轻摇 15 分钟，约 14,000 × g 15 分钟澄清。
当场检查：湿沉淀质量、缓冲液体积以及两个不同离心阶段都已记录。
2C · CST 直接 SDS 样本[CST-WB]
1× PBS 清洗培养物并吸尽，6 孔板每孔加 100 µL 或 10 cm 皿加 500 µL 新鲜 1× SDS sample buffer。立即刮取、冰上保存，超声 10–15 秒；取 20 µL 加热 95–100 °C 5 分钟、冰上冷却，再微量离心 5 分钟；原厂未指定这一步的离心力，记录实验室实际设置。
当场检查：样本均匀、可吸取；加热分装管的标记清楚。
3 · 保持样本组分分开[THERMO-89900]
RIPA 澄清后把上清移到新管，留下碎屑沉淀。Thermo 可选超声提示明确是对沉淀做 30 秒、50% pulse 处理以提高产量，不是要求每个澄清上清都超声。
当场检查：保留沉淀、沉淀回收和可溶上清分别标记；若尝试回收，记录重悬和再次澄清的方法，不要猜说明书省略的细节。
4 · 单独完成直接 SDS 分支[CST-WB]
CST 加热冷却后要求微量离心 5 分钟再上样；原页面没有指定该步离心力，应记录实验室已验证做法，不要把 RIPA 的 14,000 × g 套进来。
当场检查：CST 直接 SDS 样本与 RIPA 上清分别放在标记清楚的管中。
5 · 对 RIPA 定量并归一化[THERMO-89900]
使用 Thermo 列出兼容的 BCA，记录稀释倍数和浓度。根据目标蛋白的预实验梯度选择上样质量。直接 SDS 记录上样体积和培养皿面积。
当场检查：浓度结果带有测定法、空白和稀释信息。
6 · 分装、标记并保存
分装工作样本并采用实验室已验证保存方法；RIPA 试剂的 4 °C 保存要求不等于裂解物长期保存验证。目标分区不确定时保留沉淀或未处理组分，上胶前标注泳道图。
当场检查：记录中能查到细胞状态、裂解液组成、体积、抑制剂和所取组分。
停止并处理：若相关沉淀已被丢弃，应明确回收问题仍未解决。
两条有效的制样路径
RIPA 得到澄清的可溶组分；直接 SDS 裂解得到含上样液的变性样本。继续上胶前，在标签中保留制样方法。
计算示例
比例算例：2.5 × 10⁶ HeLa 细胞
Thermo 的起始比例是 5 × 10⁶ HeLa/A431 对应 1 mL。若准确估计 HeLa 样本为 2.5 × 10⁶ 细胞，线性缩放得到一个数学起点，并不证明提取产量相同。
1,000 µL × (2.5 × 10⁶ ÷ 5 × 10⁶) = 500 µL 冷 RIPA。
记录细胞估计法和实际体积。若浓度过低，说明书允许直接皿上裂解时用更少缓冲液；先用小体积做预实验，并记录目标蛋白的回收情况。
避免得到无法解释的裂解物
- RIPA 在规定的冰上孵育期间保持低温；批号和抑制剂加入时间已记录。
- 记录培养面积或湿沉淀质量，使缓冲液体积可追溯到来源比例。
- RIPA 澄清上清和沉淀没有在未说明的情况下重新混合。
- BCA 使用去污剂兼容方法和匹配空白；不把 A280 当作通用 RIPA 浓度读数。
- 不要把直接 SDS 与 RIPA 按“上样体积相同”理解为蛋白质量相同。
裂解物看起来不对时
RIPA 裂解物拉丝、难吸取[THERMO-89900]
解释
核酸或破碎不足可能影响黏度，但仅凭它不能确定缺失目标在哪个组分。
下一步
记录黏度、保留组分并选择兼容目标的破碎方法。Thermo 的 30 秒/50% pulse 是沉淀回收选项，不是所有裂解物的万能处理。
磷酸化信号异常弱[THERMO-89900]
解释
RIPA 产品不含磷酸酶抑制剂，处理过程中可能丢失磷酸化。
下一步
在使用前立即加入兼容磷酸酶抑制剂并减少升温时间；不要直接声称目标蛋白不存在。
沉淀被丢弃但膜蛋白目标缺失[THERMO-89900]
解释
目标可能留在不溶部分；RIPA 上清不等于总回收。
下一步
保留沉淀重复，并测试有验证依据的分级或增溶分支。
直接 SDS 泳道过载或无法吸取[CST-WB]
解释
培养皿体积和上样孔/样本状态不匹配。
下一步
记录实际体积，按 CST 加热后澄清，并调整下一次样本输入；不要把它改称 RIPA。
FAQ
Thermo 比例适用于每种细胞系吗？[THERMO-89900]
不适用。说明书用 HeLa 和 A431 给出 5 × 10⁶ 细胞示例；其他细胞系应把它作为起始条件并记录实际回收。
抑制剂可以前一天加入吗？[THERMO-89900]
Thermo 要求在使用前立即加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂；除非抑制剂说明另有兼容方案，应遵循该时间。
为什么保留沉淀？[THERMO-89900]
RIPA 上清只是当前方法得到的可溶组分；保留沉淀可以检验缺失目标是否仍在不溶部分。
CST 的 20 µL 是统一上样量吗？[CST-WB]
不是。CST 在 10 × 10 cm 胶示例中给出 20 µL；孔容量、浓度和目标丰度仍需决定实际体积。
厂商流程与说明书
每项条件旁的来源标记均链接到相应厂商说明。
- THERMO-89900 · Thermo Scientific — RIPA Lysis and Extraction Buffer (89900/89901), MAN0011565 Rev. B.0
第 1–2 页：配方、HeLa/A431 比例、贴壁冰上 5 分钟/悬浮 15 分钟、约 14,000 × g 15 分钟、可选沉淀超声及抑制剂加入时间。
- THERMO-FAQ · Thermo Scientific — RIPA 89900/89901 Product FAQs
89900/89901 产品 FAQ：RIPA 的强 A280 吸收、兼容比色测定和抑制剂时间。
- CST-WB · Cell Signaling Technology — Western Blotting Protocol
B 节：直接 SDS 的体积、超声、加热和上样；A/C/D 节：0.2 µm NC、封闭/稀释液、100 cm² 膜面积对应体积，以及指定 HRP/ECL 条件。
记录结果与相关指南
保存实验条件、原始图像和结果判断。下方提供记录单，以及制样、上样、转膜和定量的相关指南。