Sample Preparation · 培养细胞
Western Blot 细胞裂解液制备：确认目标蛋白回收
培养细胞裂解是否合格，应根据目标蛋白回收、蛋白定量兼容性和后续 SDS-PAGE 表现判断。收样后还需注意目标是否留在不溶性沉淀中，以及 DNA 黏度是否影响移液和上样。
本页解决的问题
全细胞裂解液也需要检查目标蛋白回收率
不同去污剂和提取试剂的回收能力及下游兼容性不同；即使都称为 RIPA，不同商业配方也需要查看实际组成和说明。首次优化时，如果目标回收不确定，应暂时保留不溶性组分用于比较。
选择细胞裂解策略
根据目标所在组分和已有抗体验证条件选择。
贴壁还是悬浮
收样机械步骤不同，但都应控制处理结束到样本稳定之间的时间。
全细胞还是分级
若生物学问题本身具有组分特异性，全细胞提取可能稀释信号或掩盖重新定位。
去污剂强度与兼容性
使用能够回收目标且与下游蛋白定量方法兼容的裂解液，不能只凭“RIPA/NP-40”名称推断。
黏度处理
基因组 DNA 会造成拉丝和上样不稳定；受控剪切可以改善移液重复性。
常见裂解方式的适用点
不同裂解体系不能只按名称互相替换。
RIPA
常见的全细胞提取起点。商业配方可能不同，需要核对去污剂组成、是否含抑制剂以及蛋白定量兼容性。
直接用 SDS 上样液裂解
部分经过验证的 Western Blot 流程直接使用 SDS sample buffer 裂解；这种方法强化变性提取，同时也会限制可用的蛋白定量方法。
更温和的非离子裂解
适用于需要较温和提取的实验，但某些膜或细胞器目标回收可能不足。
组分分离
目标回收或生物学问题具有组分特异性时可采用分级，并通过分级纯度标志验证分离结果。
细胞裂解液制备流程
1. 按固定时间结束生物学处理
怎么做
按固定时间表收集培养皿或细胞沉淀，并使用验证过的洗涤/收样方法。
当场检查
记录细胞系、汇合度/细胞量背景、处理和收样时间。
何时停下来处理
样本收集延迟明显不同，或存在明显死亡/污染时，应先处理生物学偏差。
2. 加入合适的裂解液
怎么做
使用经过验证且足以覆盖样本的体积，避免不必要的过度稀释。
当场检查
记录准确的缓冲液/产品以及使用前临时加入的抑制剂。
何时停下来处理
当前化学体系预计不能回收目标组分时，应先更换或验证提取体系。
3. 完成破碎并控制黏度
怎么做
充分刮取/重悬，并在需要时采用验证过的剪切或超声。
当场检查
样本应能够稳定移液，并记录明显拉丝、升温或起泡。
何时停下来处理
仍有明显未裂解物或黏度高到无法重复移液时，应先处理裂解问题。
4. 澄清时保留可用于判断的组分
怎么做
采用方法专属的澄清条件并干净转移目标组分。
当场检查
首次优化时，目标回收不确定就比较上清和沉淀。
何时停下来处理
异常大的沉淀提示裂解不完全或目标损失时，应暂停并检查。
5. 在实际裂解基质中做蛋白定量
怎么做
根据实际缓冲液组成选择 BCA、Bradford、660 nm 或其他方法。
当场检查
用标准、空白和样本稀释识别基质干扰。
何时停下来处理
缓冲液成分超过蛋白定量方法兼容上限时，不应继续使用该方法。
6. 准备 SDS-PAGE 样本
怎么做
统一计划上样的蛋白量，同时让各泳道样本化学尽量一致，再加入合适上样液和还原剂。
当场检查
记录最终蛋白质量、泳道体积、加热和还原条件。
何时停下来处理
出现沉淀，或等蛋白量造成各泳道体积/化学组成差异过大时，应先调整样本。
建议记录的信息
根据裂解液表现排查
先确认样本制备，再调整下游条件。
观察
裂解液拉丝、很难移液
解释
高分子 DNA 和剪切不足很可疑。
下一步
采用验证过的剪切/超声，并重新观察泳道形态。
先不要做
不要依靠目测随意改变不同泳道的上样体积。
观察
上清没有目标，但沉淀中有
解释
当前主要问题是目标回收。
下一步
换成目标兼容的提取或分级方案。
先不要做
此时增加一抗不会解决提取不足。
观察
总蛋白浓度异常低
解释
裂解液过多、裂解不足、定量干扰或起始细胞量低都可能。
下一步
逐项检查这些因素。
先不要做
原因不清楚时不宜直接浓缩样本。
观察
加热/还原后样本出现沉淀
解释
可能存在目标特异性聚集或缓冲不兼容。
下一步
有明确依据时比较替代制样条件，其余变量保持一致。
先不要做
更强的煮沸条件不一定能改善结果。
相关实验指南
本页主要依据
厂商流程中的具体体积和超声条件只适用于相应验证体系，不宜直接泛化。
- Thermo Fisher Scientific — RIPA Lysis and Extraction Buffer
用于核对该 RIPA 配方的提取范围、抑制剂需求和下游兼容性。
- Thermo Fisher Scientific — Protein assay compatibility troubleshooting
用于核对去污剂、还原剂和螯合剂对 BCA、Bradford 等蛋白定量方法的影响。
- Cell Signaling Technology — Western blot troubleshooting
用于核对裂解不完全、样本黏稠和电泳前样本处理问题。
- Cell Signaling Technology — Western blot sample preparation protocol
用于核对 direct SDS 裂解、DNA 剪切和样本制备的一套厂商实例。