上样前检查
Western Blot 上样前实验设计清单
不少实验问题在上样前就可以发现，例如没有可靠阳性对照、样本组分选错、凝胶或转膜条件不覆盖目标分子量，以及计划定量却没有验证线性范围。
上样前核对 6 项信息
01
目标蛋白
检测哪个具体蛋白、异构体或修饰位点？在当前样本中预期表观分子量是多少？
02
生物学条件
该细胞、组织或处理在取样时间点是否应当表达目标？有没有合适的阳性样本可以验证？
03
样本组分
目标主要位于可溶组分、膜、细胞核、细胞骨架、分泌组分，还是其他需要富集的部分？
04
表位与制样条件
还原、加热、交联或样本化学组成是否可能影响该抗体识别的表位？
05
抗体验证信息
该抗体是否在相近物种和样本中做过 Western Blot 验证？产品页显示的预期条带和推荐条件是什么？
06
定量目的
本实验只看有无、比较变化，还是需要定量？目标和归一化信号分别需要在哪个范围内保持可用响应？
实验中需要设置哪些对照
| 对照 | 内容 | 用途 |
|---|---|---|
| 阳性样本 | 已知含有目标蛋白 | 确认当前样本制备、抗体和检测条件能够得到预期条带 |
| 阴性/敲除样本 | 目标已知缺失或降低 | 判断条带是否随目标蛋白变化 |
| 不加一抗对照 | 只加入二抗 | 检查二抗和底物背景，不能单独证明一抗特异性 |
| 归一化对照 | 已验证稳定内参或总蛋白 | 支持泳道间比较 |
| 转膜图 | Ponceau S 或其他总蛋白染色 | 帮助区分转膜/上样问题与后续抗体问题 |
凝胶、转膜、抗体与定量条件
凝胶与预期分子量
- •根据所用凝胶体系的分离范围选择浓度或梯度，不直接套用脱离体系的通用浓度表。
- •目标范围较宽，或目标与对照分子量相距较大时，可考虑合适的梯度胶。
- •目标和内参过于接近时，条带可能无法清楚分开，也会影响独立定量。
膜与转膜
- •低分子量蛋白可根据目标大小考虑 0.2 µm 膜；具体孔径仍需结合转膜系统和目标验证。
- •大分子蛋白通常更需要充足的转膜时间和稳定散热，同时要检查是否仍滞留在胶内。
- •在抗体孵育前安排 Ponceau S 或其他可逆总蛋白染色，保存整张膜的转膜结果。
封闭与抗体
- •从具体抗体说明书中验证过的稀释液、稀释倍数和孵育条件开始。
- •Milk 或 BSA 的选择取决于具体抗体和检测体系，仅凭“磷酸化抗体”标签不能决定。
- •记录抗体货号和批次；更换批次后，关键实验可重新确认工作条件。
检测与定量
- •根据灵敏度、多重检测需求和现有仪器选择化学发光或荧光检测。
- •计划多个曝光时间，并保存未饱和原始图像。
- •需要定量时，用预实验确认目标和归一化信号在计划上样量附近都处于可用响应范围。
建议的首轮预实验
要回答的问题
供应商验证过的抗体能否在当前实验体系中检测到目标？
固定条件
样本制备、凝胶、转膜、二抗、检测方式和曝光系列保持一致。
比较对象
将已知阳性样本与实验样本并排，先使用供应商推荐的一抗条件。
结果判断
阳性样本也失败时，优先检查方法和抗体链；阳性样本正常而实验样本失败时，再检查目标表达或提取。
下一轮预实验
根据结果只调整一个变量，例如上样量、一抗稀释或转膜条件。
建议先补齐信息再上样的情况
如果还没有可信阳性对照、不清楚预期条带位置、不知道抗体的验证条件、没有转膜检查方案，或计划定量却没有未饱和成像和线性范围策略，建议先解决这些问题再进入正式实验。
