上样前决策
上样前完成 Western Blot 实验设计
很多高成本失败在实验设计阶段已经出现：没有验证阳性对照、样本组分不对、目标超出转膜条件适用范围，或计划定量却没有线性范围策略。
先回答六个问题
01
目标身份
检测的是哪个具体蛋白、异构体或修饰位点？在当前样本中预期表观分子量是多少？
02
生物学背景
为什么该细胞、组织或处理在取样时间点应当表达目标？
03
样本组分
目标属于可溶性、膜相关、核、细胞骨架、分泌蛋白还是其他富集组分？
04
表位兼容性
还原、煮沸、交联或样本化学组成是否会影响抗体表位？
05
抗体证据
该抗体是否在相近物种和样本中完成 WB 验证？说明书显示的条带模式是什么？
06
定量目标
本实验是定性、比较还是定量？哪些信号必须保持在线性范围内？
对照不是装饰，而是诊断工具
| 对照 | 内容 | 能够回答的问题 |
|---|---|---|
| 阳性样本 | 已知含有目标蛋白 | 证明目标特异性的完整链路能够工作 |
| 阴性/敲除样本 | 目标已知缺失或降低 | 检验目标依赖的特异性 |
| 不加一抗对照 | 只加入二抗 | 检查二抗/底物背景，不能证明一抗特异性 |
| 归一化对照 | 已验证稳定内参或总蛋白 | 支持泳道间比较 |
| 转膜图 | Ponceau S 或其他总蛋白染色 | 区分转膜/上样问题与抗体问题 |
四组关键选择
凝胶与预期分子量
- •根据凝胶供应商的分离范围图选择，而不是机械套用一张通用浓度表。
- •当目标范围较宽，或目标与对照分子量相距很大时，梯度胶更实用。
- •不要让目标和内参过于接近，以至于无法分辨或独立定量。
膜与转膜
- •小分子蛋白可优先考虑 0.2 µm 膜；更大孔径常用于更宽的常规范围。
- •大分子蛋白通常需要有效散热、足够时间，以及避免其滞留在胶内的条件。
- •在抗体孵育前预先安排可逆总蛋白染色，让转膜结果可观察。
封闭与抗体
- •从抗体说明书验证过的稀释液和稀释倍数开始。
- •奶粉或 BSA 的选择取决于具体抗体，仅凭“磷酸化抗体”标签不足以决定。
- •记录货号和批次；即使名义协议相同，不同批次也应确认表现。
检测与定量
- •根据灵敏度、多重检测和仪器条件选择化学发光或荧光。
- •预先计划多个曝光并保存未饱和图像。
- •需要定量比较时，先通过预实验确保目标与归一化信号都在线性范围内。
推荐的第一轮最小预实验
问题
验证过的抗体能否在我的样本体系中检测到目标？
保持不变
样本制备、凝胶、转膜、二抗、检测和曝光系列。
进行比较
把验证过的阳性对照与实验样本并排，先使用供应商推荐的一抗条件。
判定
阳性对照失败，优先排查方法/抗体链；阳性对照成功而实验样本失败，优先调查生物学或提取。
下一轮
之后再只滴定一个变量，例如上样量、一抗稀释或转膜条件。
上样前停止条件
以下任一项无法回答时，继续上样通常只是把不确定性带入更昂贵的步骤：没有可信阳性对照、不知道预期条带位置、不知道抗体验证条件、没有转膜验证方案，或计划定量却没有未饱和成像策略。
