Sample Preparation · 组织
Western Blot 组织样本制备：采集、匀浆与目标蛋白回收
组织样本还受到细胞外基质、脂质、结缔组织和细胞组成异质性的影响。评价组织制备时，除了观察匀浆是否充分，还应确认目标蛋白能否稳定回收，以及待测修饰状态是否得到保存。
本页解决的问题
清澈的组织上清也可能丢失目标蛋白
过度澄清可能同时丢弃膜性或不溶目标；破碎不足则会留下组织块并造成回收率波动。组织制备应根据目标回收率和后续泳道质量判断，而不能只看上清是否清澈。
开始前需要确定的 4 项条件
取材前先确定采集、稳定和机械破碎方式。
采集与稳定
记录取材到冷冻/裂解的时间，并让不同实验组的处理历史一致。
组织物理性质
软组织、纤维组织、脂质丰富组织和极少量样本需要不同的破碎与冷却策略。
目标所在组分
明确目标应位于全组织提取物，还是某个容易在澄清时损失的组分。
匀浆设备尺度
让探头、珠子、管体和样本/缓冲体积匹配具体设备，不照搬另一台设备的固定循环次数。
不同组织类型需重点调整的条件
以下条件需要根据具体组织和设备验证。
纤维组织
机械破碎不足可能比延长去污剂孵育更限制回收，应优先解决样本尺寸和设备匹配。
脂质丰富组织
浮脂层和相污染会影响回收与蛋白定量；应明确保留哪一层，并在所有样本中采用一致规则。
极小样本
死体积和吸附损失比例更高，不宜仅为方便匀浆而使用过量裂解液。
磷酸化目标
采集速度、低温和磷酸酶抑制剂的加入时间可能比最终总蛋白产量更重要。
组织样本制备流程
1. 稳定并记录组织
怎么做
按验证过的新鲜/冷冻流程快速处理，并保证实验组间一致。
当场检查
记录组织身份、质量/尺寸、取材时间和保存历史。
何时停下来处理
不同组的温热暴露或反复解冻明显不一致时，应先解决前处理偏差。
2. 把组织处理到适合匀浆的尺度
怎么做
使用低温工具，将样本尺寸调整到所用匀浆设备可重复处理的范围。
当场检查
各样本进入匀浆步骤时尺寸和输入方式应一致。
何时停下来处理
设备过载或大块组织无法稳定处理时，不应继续。
3. 在冷却条件下匀浆
怎么做
采用设备厂商或实验室验证过的程序，并加入足够且兼容的裂解液。
当场检查
检查残留组织、升温、起泡和工具表面的样本损失。
何时停下来处理
明显升温或验证循环后仍有完整组织时，应先解决匀浆问题。
4. 仅在需要时继续裂解或剪切
怎么做
按验证方法追加机械处理或超声。
当场检查
观察黏度和回收率，而不是单纯增加机械能量。
何时停下来处理
起泡或升温继续增加而回收不再改善时，应停止追加处理。
5. 澄清并保留可用于判断的组分
怎么做
使用验证过的澄清步骤；首次优化时保留不溶性材料，直到确认目标回收情况。
当场检查
记录沉淀、脂质层，必要时比较不同组分。
何时停下来处理
目标富集在通常被丢弃的组分时，应先修改提取方法。
6. 定量并统一上样条件
怎么做
使用与实际组织裂解基质兼容的蛋白定量法，并让各泳道化学组成尽量一致。
当场检查
检查标准曲线、样本稀释和重复一致性。
何时停下来处理
出现非线性或明显基质干扰时，不应继续使用该浓度值。
组织制备应保留的信息
根据组织制备结果排查
目标信号偏弱时，先检查组织破碎和目标回收情况。
观察
仍有明显大块组织残留
解释
机械破碎不完整。
下一步
先修正样本尺寸、工具或程序匹配。
先不要做
单纯增加起始组织量不会解决破碎不足。
观察
目标主要在沉淀中
解释
当前提取/澄清方法没有回收目标组分。
下一步
比较其他有依据的提取或分级策略。
先不要做
丢弃沉淀后不能再把目标弱简单归因于抗体。
观察
相似组织输入的蛋白产量波动很大
解释
匀浆、缓冲比例、脂质处理或定量干扰可能不一致。
下一步
先核对这些变量，再根据浓度进行上样归一化。
先不要做
浓度归一化不能纠正有偏的提取过程。
观察
磷酸化信号随处理延迟明显变化
解释
取材后的处理过程可能正在改变待测修饰状态。
下一步
标准化采集、稳定和抑制剂加入时序。
先不要做
此时不宜先增加总蛋白上样量。
相关实验指南
本页主要依据
CST 的组织提取流程是一套厂商验证实例，其中具体组织尺寸、匀浆次数和超声条件不适用于所有组织和设备。
- Thermo Fisher Scientific — RIPA Lysis and Extraction Buffer
用于核对该 RIPA 配方的提取范围、抑制剂需求和下游兼容性。
- Thermo Fisher Scientific — Protein assay compatibility troubleshooting
用于核对去污剂、还原剂和螯合剂对 BCA、Bradford 等蛋白定量方法的影响。
- Cell Signaling Technology — Western blot troubleshooting
用于核对裂解不完全、样本黏稠和电泳前样本处理问题。
- Cell Signaling Technology — preparing tissue extracts for Western blot
用于核对低温处理、Dounce 匀浆、超声和澄清的组织提取实例。