Wet Transfer 实操
Western Blot Wet Transfer：Tank 转膜实验步骤
已经确定使用 tank/wet transfer 后，可按本页核对组装、排泡、散热和转膜后的检查。具体电参数程序仍以实际 transfer cell 说明书为准。
本页解决的问题
先保证夹层方向、胶膜接触和供电正常
不少 wet transfer 失败来自组装和供电：膜放错一侧、气泡阻断胶膜接触、pad 未完全浸润或失去弹性、转膜液液位不足，或者槽体明显过热。这些问题应在抗体孵育前发现。
准备工作
按实际 transfer cell、cassette 面积和膜对应的说明书准备转膜液和电参数。不同设备中的“100 V 1 h”等条件不能直接互相套用。
转膜液
按设备或 protocol 的确切配方准备新鲜 transfer buffer；需要低温时提前冷却。实验记录中写清完整配方，不只写“transfer buffer”。
膜
PVDF 按膜厂商要求先用相应有机溶剂预润湿，再放入转膜液平衡；NC 通常可直接用水或转膜液润湿。操作过程中保持膜湿润，并用干净镊子或手套接触。
夹层方向
常规 SDS 变性蛋白按 cathode → gel → membrane → anode 组装。实际操作仍要核对设备颜色和极性标识，确保蛋白从胶向膜迁移。
散热
Tank transfer 运行时间较长时会产生热量。按设备要求使用 cooling pack、冷室、冰浴或循环冷却，并遵守设备温度和电流限制。
Tank Transfer 操作步骤
1. 平衡凝胶并准备膜
怎么做
电泳结束后，将胶放入适合该凝胶和系统的转膜液中平衡，同时按膜材料说明完成预处理。
当场检查
胶和膜都完全润湿、平整、尺寸合适，膜边缘没有干燥。
何时停下来处理
胶明显撕裂或变形，或 PVDF 出现不能均匀润湿的区域。
2. 充分浸润 pad 和滤纸
怎么做
将 pad 和滤纸完全浸入转膜液，并在组装前排出其中空气。
当场检查
Pad 有弹性且完全饱和；滤纸覆盖胶且无干角或折叠。
何时停下来处理
Pad 已永久压扁、明显脏污、破损或内部存在难以排出的气泡。
3. 按 cathode → gel → membrane → anode 组装
怎么做
在转膜液中或充分润湿的表面完成夹层。常规 SDS 蛋白的膜位于胶的 anode/正极一侧。
当场检查
关闭 cassette 前，再与设备说明书核对颜色和电极方向。
何时停下来处理
无法明确识别当前 cassette 的正负极方向。
4. 每铺一层都排泡
怎么做
轻柔地从中心向外滚压，特别注意 gel–membrane 接触面；避免拉伸或推移凝胶。
当场检查
胶和膜之间没有可见气泡、褶皱或干区。
何时停下来处理
气泡无法在不移动或损伤夹层的情况下排掉时，应打开重新组装。
5. 放入槽体并建立散热
怎么做
按正确方向插入 cassette，加液到规定液位，安装搅拌或散热组件（如设备要求），再连接电源。
当场检查
Cassette 按要求浸没，回路连通，初始电流/电压表现与该设备的正常范围相符。
何时停下来处理
电流为零、异常高或低、发生漏液，或温度快速异常上升。
6. 运行设备对应的转膜程序
怎么做
采用该 transfer cell 已验证的程序，记录模式、设定值、实际 current/voltage、时间和散热细节。
当场检查
供电稳定，槽体没有异常过热，也没有触发电源限制。
何时停下来处理
电源跳停、电流大幅异常漂移或槽体过热。
7. 封闭前检查转膜结果
怎么做
小心拆开夹层并保留方向信息，用 Ponceau S 或兼容总蛋白染色检查整张膜；必要时同时检查转膜后胶。
当场检查
整膜存在清楚且足够均匀的蛋白转移，可支持当前实验。
何时停下来处理
出现整膜近乎空白、气泡样局部缺失、明显泳道变形或某个分子量区域转膜不足。
转膜气泡会造成固定位置的局部空白
相邻泳道在同一膜位置出现浅色区域时，应先检查总蛋白转膜图和 gel–membrane 接触。
每次 Wet Transfer 建议保留
Wet Transfer 常见问题
调整转膜时间或电参数之前，先确认胶膜接触、极性和供电系统没有问题。
观察
Ponceau 显示整张膜几乎空白
解释
更符合组装、极性、回路或转膜液问题。
下一步
检查膜所在一侧、cassette 方向、电极、液位、转膜液和供电表现；抗体条件保持不变重做。
先不要做
不要从延长一抗孵育开始。
观察
出现边界清楚的局部浅色区域
解释
气泡或局部接触不良最可疑。
下一步
重新组装并彻底排泡，同时检查 pad 和滤纸状态。
先不要做
提高 voltage 不能修复胶膜接触问题。
观察
高分子量区域仍留在胶内
解释
当前条件对该分子量区域转膜不足。
下一步
进入 Optimization / Large Proteins 页面，根据转膜后胶和膜图一次调整一个变量。
先不要做
实验同时关注小分子时，不要默认转膜越久越好。
观察
槽体发热或电流明显异常
解释
电系统、转膜液或散热可能超出预期工作状态。
下一步
停止运行，核对转膜液组成、槽体设置和散热，再在设备允许范围内重新开始。
先不要做
电源尚未自动断电不代表可以继续运行。
相关 Wet Transfer 专题
主要参考来源
具体 transfer cell 的转膜液体积、cassette 方向细节和电学上限以设备说明书为准。
- Bio-Rad — Separating Proteins to a Blotting Membrane
用于核对 wet-transfer 组装、膜预处理、排泡、极性和可逆染色。
- Thermo Fisher Scientific — Western Blotting Support: Troubleshooting
用于核对胶膜接触、转膜液、电流表现、反向组装和转膜后排错。
- Towbin, Staehelin & Gordon (1979) — Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets
经典 electrophoretic transfer 方法学来源。