Wet Transfer 实操
Western Blot Wet Transfer：Tank 转膜实验步骤
已经确定使用 tank/wet transfer 后，可按本页核对组装、排泡、散热和转膜后的检查。具体电参数程序仍以实际 transfer cell 说明书为准。
实验台手册 · 湿转
Bio-Rad Mini Trans-Blot 湿转
这是针对 Bio-Rad Mini Trans-Blot（170-3930/170-3935/170-3989/170-3836 系列）的设备专用湿转起始流程。夹层顺序、冷却、搅拌和电参数属于该设备；不要在没有另一台槽体说明书的情况下照搬。
步骤旁的来源标记可跳转到本页末尾的厂商流程与说明书。
设备与膜的范围
手册支持最多两个 cassette，最大 mini 胶为 7.5 × 10 cm。更大的胶或超过两个 mini 胶需要其他 Bio-Rad 槽体。
本页工作缓冲液为 Bio-Rad buffer A：25 mM Tris pH 8.3、192 mM glycine、20% v/v methanol。手册也列出可选 SDS 和其他缓冲体系；需要优化时，每次只测试一种改变。
常规 SDS 蛋白向阳极/正极迁移；酸性转膜时手册要求调换胶和膜，因为蛋白向阴极迁移；不能沿用常规方向。
槽体、夹板与转膜材料
Mini Trans-Blot 槽和 gel-holder cassette[BIORAD-MTB]
170-3930、170-3935、170-3989、170-3836 系列；适配 7.5 × 10 cm mini 胶。
蓝色 Bio-Ice 冷却单元[BIORAD-MTB]
−20 °C 保存，转膜时装在槽体内。
新鲜 buffer A[BIORAD-MTB]
每升 3.03 g Tris、14.4 g glycine、200 mL methanol，加 ddH₂O 至 1 L；装冷却单元约需 950 mL。
膜和滤纸[BIORAD-MTB]
按胶尺寸裁切或使用预裁材料；戴手套。PVDF 先用 100% methanol 润湿，再平衡到转膜液。
纤维垫、搅拌子和搅拌板[BIORAD-MTB]
手册要求转膜中使用搅拌子，以保持温度和离子分布均匀。
可逆总蛋白染色和 marker[BIORAD-CHECK]
Bio-Rad 认为膜染色比只观察 marker 更可靠；封闭前保留转膜后的胶。
电参数、缓冲液和膜选择
窄屏可左右滚动查看完整参数表。
| 参数 | 起始条件 | 使用说明 |
|---|---|---|
| 过夜转膜 | 30 V 恒压；表中参考电流 90 mA[BIORAD-MTB] | Bio-Rad 对 SDS-PAGE 胶和 A–C 缓冲液给出的过夜起点；必须冷却和搅拌。 |
| 一小时转膜 | 100 V 恒压；表中参考电流 350 mA[BIORAD-MTB] | 同一胶/缓冲液组的一小时高强度起点。 |
| 胶/膜平衡 | 根据胶厚 15–20 分钟[BIORAD-MTB] | 去除盐分，使低浓度胶适应甲醇，并减少失控发热。 |
| Buffer A 配方 | 25 mM Tris pH 8.3、192 mM glycine、20% methanol[BIORAD-MTB] | 每升使用 3.03 g Tris + 14.4 g glycine + 200 mL methanol；不要自行加酸碱调节。 |
| 膜孔径 | CST 示例使用 0.2 µm NC；Bio-Rad 介绍 0.45/0.2 µm NC 和 0.2 µm PVDF[BIORAD-MTB] | 小分子可能穿过 0.45 µm NC；PVDF 结合容量较高但需先用醇润湿。 |
先区分大分子未转出与小分子保留不足
大分子可能仍留在胶内，小分子可能穿膜或在后续处理时丢失。结合转膜后胶、膜总蛋白染色和必要时的第二层捕获膜判断，再决定下一轮改变时间、膜孔径或缓冲液；图示不能替代上表的设备专用程序。
预计用时与检查要点
跑胶结束前
配缓冲液、裁材料；蓝色冷却单元在使用前保持冻存。
设备和程序已记录。
平衡 · 15–20 分钟
胶、膜、纸和垫平衡；PVDF 先单独用醇润湿。
各层湿润、平整，可组装。
转膜 · 一小时或过夜
100 V 恒压一小时，或 30 V 恒压过夜，持续冷却/搅拌。
记录电流、时间和温度观察。
转膜结束立即
断电 → 打开 → 拍染色 → 保留胶 → 作判断 → 封闭。
免疫检测前已有转膜证据。
夹层组装与转膜
湿转的关键是夹层顺序和排气。目标泳道下的一个气泡就能造成像抗体失败一样的局部空白。
1 · 安全准备槽体[BIORAD-MTB]
用温和实验室清洁剂清洗槽、夹板、电极和纤维垫，再用蒸馏/去离子水冲洗。处理盖子或夹板时保持电源关闭。
当场检查：铂丝完整，冷却单元已冻好，槽体型号和夹板尺寸匹配胶。
停止并处理：盖子互锁、电极丝或夹板卡扣损坏时停止。
2 · 配制新鲜 buffer A[BIORAD-MTB]
混合 3.03 g Tris、14.4 g glycine 和 200 mL 分析纯 methanol，加 ddH₂O 至 1 L；可以预冷至约 4 °C。不要重复使用或稀释到低于配方。
当场检查：记录批号、日期和 methanol 等级。
3 · 平衡各层[BIORAD-MTB]
按胶尺寸裁膜和滤纸。胶、膜、滤纸和纤维垫在转膜液中浸泡 15–20 分钟。PVDF 先用 100% methanol 润湿，再转入转膜液。
当场检查：组装前没有干角或卷曲的膜。
4 · 按顺序组装夹层[BIORAD-MTB]
灰色面向下，依次放纤维垫、滤纸、平衡后的胶、膜、滤纸和第二个纤维垫。常规 SDS 转膜膜位于阳极/正极侧。用玻璃管或滚轮轻排气，合上并锁紧。
当场检查：目标泳道无气泡，胶和膜边缘对齐。
停止并处理：目标泳道存在气泡时，打开重装；加大电压无法修复接触失败。
5 · 装冷却、加液并搅拌[BIORAD-MTB]
夹板装入电极模块，加入冻好的蓝色冷却单元，加液至 blotting 刻度，放入搅拌子。全程以不飞溅为限尽量搅拌，保持温度和离子分布。
当场检查：冷却单元完全浸入，缓冲液覆盖夹板。
6 · 选择一个电程序[BIORAD-MTB]
一小时高强度起点为 100 V 恒压；过夜起点为 30 V 恒压。表中 350/90 mA 是参考读数，实际电流随电导、温度和夹板数改变；应按电源手册设置保护限值，而非同时恒流。不要超过手册电压；提高电压时必须同时缩短时间。
当场检查：记录电压、电流、起止时间、夹板数、冷却和搅拌是否持续。
7 · 封闭前验证转膜[BIORAD-CHECK]
断电后打开，拍摄可逆总蛋白染色并保留胶。可见 marker 只支持其中的蛋白转移，不代表每个目标完整转移；按染色试剂说明去除染色再封闭。
当场检查：图像记录标注膜方向、目标区域、染色结果和转膜后胶评估。
Mini Trans-Blot 夹层方向
常规 SDS 蛋白从胶向阳极/正极迁移；图中顺序与 Bio-Rad 夹板说明一致。
计算示例
改变下一轮设计的一次转膜检查
假设 120 kDa 目标缺失，小分子预染 marker 可见，但转膜后胶染色显示高分子区域仍有大量蛋白。这支持洗脱不足，而不能证明抗体失败。
保持样本、抗体、膜和胶不变；配对预实验比较一小时程序和来源匹配的 30 V 过夜程序。
若高分子从胶离开并出现在膜上，转膜干预有证据；若仍留在胶上，检查胶孔径/缓冲变量；若离胶却不在膜上，检查结合或丢失。同时保存膜和转膜后胶的图像。
转膜质量检查
- 胶尺寸和夹板匹配；手册最大 7.5 × 10 cm，最多两个夹板。
- 平衡 15–20 分钟，使用新鲜且配方正确的 buffer A。
- 合夹前检查极性并排除气泡。
- 使用冻好的蓝色冷却单元和搅拌子；电导率会改变温度和电流。
- 把电压、电流、时间、夹板数和膜孔径与图像一起保存。
- 确认膜上转膜结果前，保留转膜后的胶。
阅读转膜后的证据
膜上出现干净的矩形空白区[BIORAD-MTB]
解释
很可能是气泡或局部胶膜接触不良。
下一步
仔细排气重装；不要先改抗体或曝光。
高分子量目标留在胶中，小分子 marker 已移动[BIORAD-MTB]
解释
醇可能使胶变紧，高分子 SDS 蛋白更难转出。
下一步
一次只改变一个变量：更长/更冷的转膜、更疏松的胶，或有记录的 SDS/低醇变体。
小分子目标在膜和胶中都不见[BIORAD-CHECK]
解释
可能穿膜或在洗涤时丢失。
下一步
测试 0.2 µm 膜或高结合容量 PVDF，并在主膜后加第二层膜检查穿膜；降低转膜强度/时间并保留 marker。
电流异常高或缓冲液快速升温[BIORAD-MTB]
解释
配方、pH、盐、温度、体积或 SDS 改变了电导和热量。
下一步
安全停机，重配新鲜缓冲液，核对配方并恢复冷却/搅拌；不要靠延长时间解决过热。
FAQ
为什么 100 V 不是所有湿转槽的通用条件？[BIORAD-MTB]
手册中的 100 V/350 mA 属于 Mini Trans-Blot 的电极距离、缓冲液和冷却系统；其他槽体的电阻和几何不同。
转膜液可以重复使用吗？[BIORAD-MTB]
Bio-Rad 不建议重复使用，因为缓冲容量和 pH 稳定性会改变。排错时应配制新鲜缓冲液。
什么时候向转膜液加 SDS？[BIORAD-MTB]
Bio-Rad 将 0.025–0.1% SDS 列为可选变量。SDS 可改善洗脱，但会提高电流/发热，并降低 NC 结合或影响抗原性；必须把它作为有记录的优化分支。
为什么 PVDF 要用甲醇？[BIORAD-MTB]
Bio-Rad 手册要求 PVDF 先用 100% methanol 润湿，再平衡；PVDF 结合容量较高，但处理和化学取舍不同。
厂商流程与说明书
设备配方以 Bio-Rad 手册为准；Bio-Rad 转膜指南用于膜染色检查；CST 用于 0.2 µm NC 示例。
- BIORAD-MTB · Bio-Rad — Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell Instruction Manual, M1703930 Rev. K
印刷页 3、6–13：容量、平衡 15–20 分钟、夹层、冷却/搅拌及表 3.1；印刷页 15–20、22–26：尺寸、SDS/醇和膜相关排错。
- CST-WB · Cell Signaling Technology — Western Blotting Protocol
B 节：直接 SDS 的体积、超声、加热和上样；A/C/D 节：0.2 µm NC、封闭/稀释液、100 cm² 膜面积对应体积，以及指定 HRP/ECL 条件。
- BIORAD-CHECK · Bio-Rad Antibodies — Separating Proteins to a Blotting Membrane
Size of the Target Protein / Confirming the Transfer：膜位置、小分子第二层捕获膜、Ponceau S 可逆检查和 marker 的局限。
记录结果与相关指南
保存实验条件、原始图像和结果判断。下方提供记录单，以及制样、上样、转膜和定量的相关指南。