Buffer de Lise RIPA

Buffer de ensaio de radioimunoprecipitação - mais comumente usado para lise celular em western blotting

Components

• 50 mM Tris-HCl, pH 7,4
• 150 mM NaCl
• 1% NP-40 (ou IGEPAL CA-630)
• 0,5% Deoxicolato de sódio
• 0,1% SDS
• Adicione fresco antes do uso: 1 mM PMSF, inibidores de protease, inibidores de fosfatase

Preparation

Dissolva os componentes em água deionizada, ajuste pH para 7,4, filtre e esterilize, armazene a 4°C. Adicione inibidores logo antes do uso. Volume final: 1 L.

Buffer de Amostra Laemmli (2X)

Buffer de amostra padrão para eletroforese SDS-PAGE

Components

• 125 mM Tris-HCl, pH 6,8
• 4% SDS
• 20% Glicerol
• 0,004% Azul de bromofenol
• 10% 2-mercaptoetanol (adicione fresco, ou use 100 mM DTT)

Preparation

Misture os componentes (exceto agente redutor), armazene à temperatura ambiente. Adicione agente redutor logo antes do uso. Para buffer 2X, misture 1:1 com amostra. Para condições redutoras, sempre adicione 2-ME ou DTT fresco.

Buffer de Transferência Úmida

Para transferir proteínas do gel para membrana PVDF ou nitrocelulose

Components

• 25 mM base Tris
• 192 mM Glicina
• 20% Metanol (para membranas PVDF)
• 0,1% SDS (opcional, para proteínas grandes >100 kDa)

Preparation

Dissolva 3,03 g de base Tris e 14,4 g de glicina em 800 mL de água deionizada, adicione 200 mL de metanol, ajuste pH para 8,3, complete para 1 L. Armazene a 4°C. Para nitrocelulose, reduza metanol para 10-15%.

TBST (Solução Salina Tamponada com Tris e Tween-20)

Buffer padrão de lavagem e bloqueio para western blotting

Components

• 20 mM Tris-HCl, pH 7,6
• 150 mM NaCl
• 0,1% Tween-20

Preparation

Dissolva 2,42 g de base Tris e 8,77 g de NaCl em 900 mL de água deionizada, ajuste pH para 7,6 com HCl, adicione 1 mL de Tween-20, complete para 1 L, misture bem. Armazene à temperatura ambiente.

5% de Leite Desnatado em TBST

Solução de bloqueio padrão para a maioria das aplicações de western blot

Preparation

Dissolva 5 g de leite em pó desnatado em 100 mL de TBST. Misture bem, pode ser necessário filtrar através de gaze para remover partículas não dissolvidas. Prepare fresco ou armazene a 4°C por até 1 semana. Agite bem antes do uso.

3-5% de BSA em TBST

Solução de bloqueio para proteínas fosforiladas ou quando o leite causa alto fundo

Preparation

Dissolva 3-5 g de BSA (albumina sérica bovina, Fração V) em 100 mL de TBST. Misture suavemente para evitar espuma. Filtre através de filtro de 0,45 μm se necessário. Armazene a 4°C. Use dentro de 1 semana.

Solução de Coloração Ponceau S

Para visualizar transferência de proteínas na membrana

Components

• 0,1% Ponceau S
• 5% Ácido acético

Preparation

Dissolva 0,1 g de Ponceau S em 100 mL de ácido acético 5%. Filtre antes do uso. Armazene à temperatura ambiente. Colore a membrana por 2-5 minutos, enxágue com água para visualizar bandas.