Western Blot Hub

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A preparação adequada de amostras é crucial para western blotting bem-sucedido. Esta seção cobre métodos detalhados para preparar amostras de diferentes fontes com instruções passo a passo.

Preparação de Lisado Celular

Protocolo detalhado para preparar lisados de proteínas de células cultivadas. Condições de lise adequadas são essenciais para manter a integridade das proteínas e prevenir degradação.

1
Remova o meio de cultura e lave as células 2-3 vezes com PBS gelado (solução salina tamponada com fosfato). Certifique-se de que todo o PBS seja removido completamente para evitar diluição do buffer de lise. Para células aderentes, adicione PBS diretamente à placa. Para células em suspensão, faça pellet das células por centrifugação a 500-1000 × g por 5 minutos.
2
Prepare o buffer de lise fresco ou use buffer alíquotado armazenado a -20°C. Adicione inibidores de protease (por exemplo, PMSF a 1 mM de concentração final, ou coquetel comercial de inibidores de protease) e inibidores de fosfatase (por exemplo, NaF a 10 mM, Na3VO4 a 1 mM) logo antes do uso. Mantenha o buffer gelado durante todo o processo.
3
Adicione volume apropriado de buffer de lise (tipicamente 100-200 μL por 10^6 células ou 100-150 μL por cm² de placa de cultura). Para células aderentes, raspe as células diretamente no buffer de lise usando um raspador de células. Para células em suspensão, ressuspenda o pellet no buffer de lise. Transfira para um tubo de microcentrífuga pré-resfriado.
4
Incube no gelo por 20-30 minutos com vórtex suave ocasional a cada 5-10 minutos. Para células difíceis de lisar, você pode estender a incubação para 45 minutos ou realizar sonicação (3-5 pulsos de 10 segundos cada no gelo).
5
Centrifuge a 12.000-14.000 × g por 15 minutos a 4°C. Isso remove detritos celulares, núcleos e material insolúvel. Para algumas aplicações, você pode precisar centrifugar em velocidades mais altas (20.000 × g) ou realizar centrifugações sequenciais.
6
Colete cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet. Transfira para um novo tubo pré-resfriado. Evite coletar qualquer material do pellet, pois pode conter agregados insolúveis que podem interferir na eletroforese.
7
Determine a concentração de proteínas usando ensaio BCA, Bradford ou Lowry. Sempre prepare uma curva padrão usando padrões BSA. Dilua as amostras se necessário para ficar dentro da faixa linear do ensaio. Concentrações típicas variam de 1-10 mg/mL para lisados celulares.

Tips:

Trabalhe rapidamente e mantenha tudo no gelo para prevenir degradação de proteínas
Use inibidores de protease frescos, pois eles se degradam com o tempo
Para proteínas fosforiladas, inibidores de fosfatase são essenciais
Evite vórtex excessivo que pode causar espuma e desnaturação de proteínas
Armazene lisados a -80°C se não forem usados imediatamente

Preparação de Amostras de Tecido

Protocolo para preparar extratos de proteínas de amostras de tecido. A homogeneização de tecido requer métodos mais vigorosos do que a lise celular.

1
Colete tecido fresco e coloque imediatamente no gelo ou congele rapidamente em nitrogênio líquido. Para tecidos congelados, mantenha congelado até estar pronto para processar. Corte o tecido em pequenos pedaços (2-3 mm³) usando um bisturi ou lâmina de barbear em uma superfície resfriada.
2
Homogeneize o tecido em buffer de lise gelado (tipicamente 10-20 volumes de buffer por peso de tecido, por exemplo, 100 mg de tecido em 1-2 mL de buffer). Use um homogeneizador mecânico, almofariz e pilão, ou sistema de batida com esferas. Para tecidos resistentes, realize homogeneização em múltiplos pulsos curtos (10-15 segundos cada) com intervalos de resfriamento.
3
Incube o homogeneizado no gelo por 30 minutos com vórtex ocasional. Para tecidos fibrosos, estenda a incubação para 45-60 minutos. Alguns tecidos podem se beneficiar de sonicação breve (3-5 pulsos de 5 segundos cada no gelo).
4
Centrifuge a 12.000-14.000 × g por 20 minutos a 4°C. Para tecidos com alto teor de lipídios, você pode precisar centrifugar em velocidades mais altas ou realizar uma etapa adicional de centrifugação.
5
Se o sobrenadante contiver detritos visíveis ou estiver turvo, filtre através de um filtro de seringa de 0,45 μm ou centrifuge novamente. Alguns protocolos recomendam filtrar através de gaze ou malha fina.
6
Determine a concentração de proteínas. Extratos de tecido tipicamente têm concentrações de proteínas mais altas (5-20 mg/mL) do que lisados celulares. Dilua conforme necessário para o ensaio de quantificação.

Tips:

Mantenha o tecido congelado até o processamento para prevenir degradação de proteínas
Use método de homogeneização apropriado para o tipo de tecido
Alguns tecidos podem exigir etapas adicionais para remover lipídios ou tecido conjuntivo
Armazene extratos a -80°C em alíquotas para evitar ciclos de congelamento-descongelamento

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Quantificação de Proteínas

A quantificação precisa de proteínas é essencial para carregar quantidades iguais de proteína. Use ensaio BCA, Bradford ou Lowry de acordo com as instruções do fabricante. Sempre prepare uma curva padrão para quantificação precisa.

Eletroforese SDS-PAGE

SDS-PAGE separa proteínas com base no peso molecular. A preparação adequada do gel e as condições de execução são críticas para a resolução. Esta seção fornece instruções detalhadas passo a passo para preparar e executar géis SDS-PAGE.

Materiais Necessários:

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Solução de Acrilamida/Bis 30% (proporção 29:1 ou 37,5:1)
Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8 (para gel de separação)
Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8 (para gel de empilhamento)
SDS 10% (dodecil sulfato de sódio)
APS 10% (persulfato de amônio) - prepare fresco
TEMED (N,N,N',N'-Tetrametiletilenodiamina)
Água deionizada
Sistema de moldagem de gel (placas de vidro, espaçadores, pentes)
Isopropanol ou butanol saturado com água (para sobreposição)

Preparação do Gel de Separação (exemplo 10%):

1
Calcular Volumes:Para um gel de separação de 10% (10 mL total): Misture 3,3 mL de acrilamida 30%, 2,5 mL de Tris-HCl 1,5 M pH 8,8, 0,1 mL de SDS 10%, 4,05 mL de água deionizada. Desgase sob vácuo por 10-15 minutos para remover oxigênio dissolvido.
2
Adicionar Agentes de Polimerização:Adicione 50 μL de APS 10% e 10 μL de TEMED. Misture suavemente girando (não faça vórtex, pois isso introduz bolhas). Despeje imediatamente na cassete do gel até cerca de 1 cm abaixo de onde o pente ficará.
3
Sobreposição:Cuidadosamente sobreponha com isopropanol ou butanol saturado com água para prevenir contato com oxigênio e criar uma superfície plana do gel. Permita polimerizar por 30-45 minutos à temperatura ambiente. Você verá uma interface clara quando a polimerização estiver completa.
4
Remover Sobreposição:Despeje a sobreposição e enxágue o topo do gel com água deionizada. Seque a superfície superior com papel de filtro, tomando cuidado para não tocar no gel.

Diretrizes de Porcentagem do Gel:

6-8%: Para proteínas >100 kDa (proteínas grandes)
10%: Para proteínas 30-100 kDa (mais comum, versátil)
12%: Para proteínas 15-60 kDa
15%: Para proteínas 10-40 kDa
18-20%: Para proteínas <20 kDa (proteínas pequenas)

Preparação do Gel de Empilhamento (5%):

1
Preparar Solução do Gel de Empilhamento:Para gel de empilhamento de 5% (4 mL total): Misture 0,67 mL de acrilamida 30%, 1,0 mL de Tris-HCl 0,5 M pH 6,8, 0,04 mL de SDS 10%, 2,25 mL de água deionizada. Desgase se o tempo permitir.
2
Adicionar Agentes de Polimerização:Adicione 25 μL de APS 10% e 5 μL de TEMED. Misture suavemente e despeje imediatamente sobre o gel de separação.
3
Inserir Pente:Rapidamente insira o pente em um ângulo para evitar bolhas, depois endireite. Permita polimerizar por 20-30 minutos. O gel deve estar pronto quando você puder ver uma linha clara nos dentes do pente.
4
Remover Pente:Cuidadosamente remova o pente e enxágue os poços com buffer de corrida ou água deionizada para remover acrilamida não polimerizada. O gel agora está pronto para carregar amostras.

Carregamento de Amostras:

1
Prepare amostras em buffer de amostra Laemmli (concentração final 1X) com 20-50 μg de proteína por poço. Para proteínas altamente expressas, use 10-20 μg. Para proteínas de baixa abundância, você pode precisar de 50-100 μg.
2
Inclua marcadores de peso molecular em pelo menos um poço. Marcadores pré-corados permitem monitorar o progresso durante a eletroforese.
3
Carregue amostras cuidadosamente usando uma pipeta, evitando bolhas. Carregue lentamente para evitar que as amostras derramem em poços adjacentes.
4
Preencha quaisquer poços vazios com buffer de amostra 1X para garantir distribuição uniforme de corrente.

Dicas para Melhor Resolução

Use APS e TEMED frescos para polimerização do gel - reagentes antigos podem não funcionar adequadamente
Desgase a solução do gel antes de adicionar APS para prevenir bolhas que podem perturbar a estrutura do gel
Permita que o gel polimerize completamente antes do uso - polimerização incompleta causa má resolução
Use porcentagem de gel apropriada para o tamanho da sua proteína - porcentagem errada leva a separação ruim
Mantenha temperatura consistente durante a eletroforese - flutuações de temperatura afetam a migração
Certifique-se de que os níveis de buffer são adequados - buffer baixo causa execução desigual
Use buffer de corrida fresco - buffer antigo pode ter pH ou condutividade incorretos
Evite sobrecarregar amostras - muita proteína causa borrão de bandas
Carregue volumes iguais quando possível - volumes diferentes podem causar distorção de pistas

Métodos de Transferência de Proteínas

Transferir proteínas do gel para a membrana é uma etapa crítica que determina a sensibilidade de detecção. Esta seção fornece protocolos detalhados para diferentes métodos de transferência.

Membrana PVDF (Recomendada):

1
Corte a membrana no tamanho (ligeiramente maior que o gel)
2
Ative a membrana imergindo em metanol 100% por 30 segundos
3
Transfira para o buffer de transferência e equilibre por 5 minutos
4
Membranas PVDF têm melhor capacidade de ligação de proteínas e durabilidade do que nitrocelulose

Transferência Úmida - Protocolo Detalhado

Método mais comumente usado, fornece excelente eficiência de transferência para proteínas de todos os tamanhos. Melhor para proteínas grandes (>100 kDa).

Materiais Necessários:

Buffer de transferência (25 mM Tris, 192 mM glicina, 20% metanol para PVDF)
Membrana PVDF ou nitrocelulose
Papel de filtro (Whatman 3MM ou equivalente)
Esponjas ou almofadas de transferência
Cassete de transferência
Tanque de transferência com sistema de resfriamento
Gelo ou pacote frio

1
Equilíbrio do Gel:Após a eletroforese, remova cuidadosamente o gel das placas. Equilibre o gel no buffer de transferência por 15-30 minutos. Isso remove SDS em excesso e melhora a eficiência de transferência. Agite suavemente durante o equilíbrio.
2
Preparação da Membrana:Para PVDF: Corte no tamanho, ative em metanol 100% por 30 segundos, depois equilibre no buffer de transferência por 5 minutos. Para nitrocelulose: Corte no tamanho e umedeça diretamente no buffer de transferência por 5 minutos.
3
Montagem da Pilha de Transferência:Monte a pilha de transferência em uma bandeja preenchida com buffer de transferência. Do cátodo (preto, negativo) ao ânodo (vermelho, positivo): (1) Esponja, (2) 3 papéis de filtro, (3) Gel (face para baixo), (4) Membrana (sobre o gel), (5) 3 papéis de filtro, (6) Esponja. Remova TODAS as bolhas de ar rolando com um tubo de ensaio ou usando um rolo. Bolhas de ar impedem a transferência de proteínas nesse local.
4
Condições de Transferência:Coloque a cassete no tanque de transferência preenchido com buffer de transferência frio. Certifique-se de que o buffer cubra a cassete. Para transferências padrão: 100V por 1 hora a 4°C (com gelo ou sistema de resfriamento). Para proteínas grandes: 70-80V por 2-3 horas. Para durante a noite: 30V durante a noite a 4°C. Certifique-se de que o buffer esteja frio e bem agitado durante a transferência.
5
Verificação da Transferência:Após a transferência, verifique a eficiência corando a membrana com Ponceau S (0,1% em ácido acético 5%) por 2-5 minutos. Enxágue com água para visualizar as bandas de proteínas. Isso confirma transferência bem-sucedida antes de prosseguir para o bloqueio. Ponceau S pode ser lavado com TBST antes do bloqueio.

Transferência Semi-Seca - Protocolo Detalhado

Método mais rápido usando buffer mínimo. Adequado para proteínas pequenas a médias (<100 kDa). Menos eficiente para proteínas grandes.

1
Preparação do Buffer:Prepare buffer de ânodo: 0,3 M Tris, 20% metanol, pH 10,4. Prepare buffer de cátodo: 25 mM Tris, 40 mM glicina, 10% metanol, 0,01% SDS, pH 9,4. Mergulhe 3 papéis de filtro em cada buffer.
2
Montagem da Pilha no Ânodo:Na placa do ânodo: Coloque 3 papéis de filtro embebidos no buffer de ânodo. Coloque a membrana PVDF ativada por cima (ou nitrocelulose umedecida). Remova bolhas de ar rolando.
3
Colocar Gel:Cuidadosamente coloque o gel equilibrado sobre a membrana. Certifique-se de bom contato e remova todas as bolhas de ar rolando.
4
Completar Pilha:Coloque 3 papéis de filtro embebidos no buffer de cátodo sobre o gel. Remova bolhas de ar. Feche o aparelho de transferência.
5
Transferência:Aplique corrente constante: 0,8-1,2 mA por cm² de área do gel. Para um mini-gel padrão (8 x 10 cm), use 15V por 30-60 minutos. Monitore a temperatura - transferências semi-secas podem superaquecer. Use resfriamento se a temperatura exceder 30°C.

Bloqueio e Incubação de Anticorpos

Bloqueio adequado e condições de anticorpos são essenciais para detecção específica com baixo fundo. Esta seção fornece protocolos detalhados para cada etapa.

Bloqueio - Protocolo Detalhado

O bloqueio previne a ligação não específica de anticorpos à membrana, reduzindo o sinal de fundo.

Blocking Solutions:

5% de Leite Desnatado em TBST (Padrão):

Dissolva 5 g de leite em pó desnatado em 100 mL de TBST. Misture bem até dissolver. Pode ser necessário filtrar através de gaze para remover partículas não dissolvidas. Prepare fresco ou armazene a 4°C por até 1 semana. Agite bem antes do uso.

Applications: A maioria das aplicações gerais, custo-efetivo, funciona bem para a maioria dos anticorpos

Limitations: Contém caseína que pode interferir com anticorpos fosfo-específicos, pode causar alto fundo para alguns anticorpos

3-5% de BSA em TBST (Para Proteínas Fosforiladas):

Dissolva 3-5 g de BSA (albumina sérica bovina, Fração V) em 100 mL de TBST. Misture suavemente para evitar espuma. Filtre através de filtro de 0,45 μm se necessário. Armazene a 4°C. Use dentro de 1 semana.

Applications: Proteínas fosforiladas, quando o leite causa alto fundo, alguns anticorpos sensíveis

Advantages: Sem interferência de caseína, menor fundo para anticorpos fosfo, mais consistente

1
Preparar Solução de Bloqueio:Prepare a solução de bloqueio fresca ou use solução armazenada (verifique a validade). Para 5% de leite: Dissolva 5 g de leite em pó desnatado em 100 mL de TBST. Misture bem girando ou invertendo suavemente até dissolver completamente (5-10 minutos). Se partículas permanecerem, filtre através de gaze ou filtro de 0,45 μm. Para BSA: Dissolva 3-5 g de BSA em 100 mL de TBST, misture suavemente para evitar espuma. Armazene a 4°C se não for usar imediatamente.
2
Remover Coloração Ponceau S (Opcional):Se você verificou a transferência com coloração Ponceau S, lave a membrana brevemente com TBST (2-3 enxágues rápidos, 30 segundos cada) para remover a coloração. Esta etapa é opcional - Ponceau S pode ser deixado, pois será removido durante as lavagens subsequentes. Escorra o excesso de TBST, mas não deixe a membrana secar.
3
Transferir Membrana para Solução de Bloqueio:Coloque a membrana com o lado da proteína para cima na solução de bloqueio. Use volume suficiente para cobrir completamente a membrana: mini-gel (8 x 10 cm) requer 10-20 mL, membranas maiores podem precisar de 30-50 mL. Certifique-se de que a membrana flutue livremente e esteja completamente submersa. Remova quaisquer bolhas de ar batendo suavemente ou usando pinças.
4
Incubar com Agitação Suave:Coloque o recipiente em um balanço ou agitador ajustado para velocidade suave (20-30 rpm). Incube à temperatura ambiente (20-25°C) por 1 hora. Para problemas de alto fundo, estenda para 2 horas ou use concentração mais alta (10% de leite). Alternativamente, o bloqueio pode ser feito a 4°C durante a noite (12-16 horas) se conveniente - isso pode melhorar a eficiência do bloqueio para algumas aplicações.
5
Prosseguir para Anticorpo Primário:Após o bloqueio, não lave a membrana. Escorra o excesso de solução de bloqueio tocando a borda em papel toalha, mas não deixe a membrana secar. Imediatamente prossiga para a incubação com anticorpo primário usando o mesmo tipo de solução de bloqueio (leite ou BSA) para diluir o anticorpo primário.

Tips:

Certifique-se de que a membrana esteja completamente submersa na solução de bloqueio - cobertura insuficiente causa alto fundo
Use agitação ou balanço suave (20-30 rpm) - agitação muito vigorosa pode danificar a membrana ou causar bloqueio desigual
O bloqueio pode ser feito a 4°C durante a noite se conveniente - isso pode melhorar a eficiência do bloqueio
Para proteínas fosforiladas, sempre use BSA, não leite - o leite contém caseína que interfere com anticorpos fosfo-específicos
Prepare a solução de bloqueio fresca quando possível - soluções armazenadas podem perder eficácia
Use volume adequado - a membrana deve flutuar livremente, não grudar nas paredes do recipiente
Não reutilize a solução de bloqueio - ela pode conter proteínas transferidas ou contaminantes

Incubação com Anticorpo Primário - Protocolo Detalhado

O anticorpo primário se liga especificamente à sua proteína-alvo. Diluição adequada e condições de incubação são críticas.

Diluição de Anticorpos:

Anticorpos monoclonais: Tipicamente 1:1000 a 1:5000 em solução de bloqueio
Anticorpos policlonais: Tipicamente 1:500 a 1:2000 em solução de bloqueio
Comece com a diluição recomendada pelo fabricante, depois otimize através de titulação
Dilua o anticorpo em solução de bloqueio (mesma solução usada para bloqueio)

Optimization: Se o sinal estiver fraco: Aumente a concentração ou estenda a incubação. Se o fundo estiver alto: Diminua a concentração ou aumente o tempo de bloqueio.

Condições de Incubação:

Durante a Noite a 4°C (Recomendado)

Melhor relação sinal-ruído, detecção mais sensível. Incube em sala fria ou geladeira com agitação ou balanço suave.

Duration: 12-16 horas

Advantages: Maior sensibilidade, melhor relação sinal-ruído, horário conveniente

Temperatura Ambiente

Método mais rápido, adequado quando durante a noite não é possível.

Duration: 1-2 horas com agitação suave

Advantages: Mais rápido, conveniente para resultados no mesmo dia

Limitations: Pode ter fundo ligeiramente mais alto, menos sensível do que durante a noite

Volume: Use volume suficiente para cobrir a membrana (tipicamente 5-10 mL para mini-gel). Pode reutilizar a solução de anticorpo 2-3 vezes se armazenada adequadamente a 4°C com conservante (0,02% de azida de sódio).

1
Calcular e Preparar Diluição de Anticorpo:Determine o volume necessário com base no tamanho da membrana: mini-gel (8 x 10 cm) requer 5-10 mL, membranas maiores precisam de 15-20 mL. Calcule o volume de anticorpo necessário. Exemplo: Para diluição 1:1000 em 5 mL, adicione 5 μL de estoque de anticorpo primário a 5 mL de solução de bloqueio. Use uma micropipeta para volumes precisos. Misture suavemente pipetando para cima e para baixo ou invertendo o recipiente 5-10 vezes. Não faça vórtex, pois pode causar espuma ou desnaturação.
2
Transferir Membrana para Solução de Anticorpo:Após o bloqueio, escorra o excesso de solução de bloqueio (não deixe a membrana secar). Coloque a membrana com o lado da proteína para cima na solução de anticorpo primário. Certifique-se de que a membrana esteja completamente coberta e submersa. Para membranas pequenas, use uma bolsa selável (remova bolhas de ar antes de selar) ou recipiente pequeno. Para membranas maiores, use uma bandeja ou recipiente com solução suficiente para cobrir completamente. Rotule o recipiente com nome do anticorpo, diluição e data.
3
Incubar na Temperatura Escolhida:Para incubação durante a noite (recomendado): Coloque em sala fria ou geladeira (4°C) com agitação ou balanço suave (20-30 rpm) por 12-16 horas. Certifique-se de que o recipiente esteja selado para prevenir evaporação. Para incubação à temperatura ambiente: Coloque em balanço à temperatura ambiente (20-25°C) com agitação suave por 1-2 horas. Monitore a temperatura - evite superaquecimento. A incubação durante a noite geralmente fornece melhor relação sinal-ruído.
4
Salvar Solução de Anticorpo (Opcional):Após a incubação, a solução de anticorpo primário pode ser salva para reutilização. Adicione 0,02% de azida de sódio (adicione 10 μL de azida de sódio 10% por 5 mL de solução) para prevenir crescimento bacteriano. Armazene a 4°C em um recipiente selado. Rotule com nome do anticorpo, diluição, data e número de usos. A maioria dos anticorpos pode ser reutilizada 2-3 vezes, mas o sinal pode diminuir com cada uso. Descarte se contaminação for suspeita.
5
Remover Membrana e Prosseguir para Lavagem:Cuidadosamente remova a membrana da solução de anticorpo usando pinças limpas. Escorra o excesso de solução tocando a borda em papel toalha. Não deixe a membrana secar. Imediatamente prossiga para as etapas de lavagem. Não lave a membrana antes deste ponto - lavar antes da incubação com anticorpo primário não é necessário e pode reduzir o sinal.

Tips:

Sempre dilua o anticorpo primário na mesma solução de bloqueio usada para bloqueio (leite ou BSA)
Use volume adequado - volume insuficiente causa ligação desigual e alto fundo
A incubação durante a noite a 4°C é recomendada para melhor relação sinal-ruído
Proteja da luz se usar anticorpos sensíveis à luz
Rotule todos os recipientes claramente com informações do anticorpo
Não deixe a membrana secar em nenhum ponto durante o processo
Pode reutilizar a solução de anticorpo primário 2-3 vezes se armazenada adequadamente com azida de sódio

Incubação com Anticorpo Secundário - Protocolo Detalhado

O anticorpo secundário é conjugado a uma molécula de detecção (HRP, corante fluorescente) e se liga ao anticorpo primário.

O anticorpo secundário reconhece e se liga ao anticorpo primário, permitindo detecção através de sua enzima conjugada (HRP) ou marcador fluorescente. Seleção adequada, diluição e condições de incubação são cruciais para relação sinal-ruído ótima. Sempre use anticorpos secundários correspondentes à espécie (anti-coelho para primário de coelho, anti-camundongo para primário de camundongo) e prepare soluções frescas para cada experimento.

Seleção de Anticorpo Secundário:

Deve ser específico para a espécie do seu anticorpo primário (por exemplo, anti-coelho para primário de coelho, anti-camundongo para primário de camundongo)
Use anticorpos secundários altamente cruzado-adsorvidos para minimizar reatividade cruzada
Escolha conjugado apropriado: HRP para quimioluminescência, corantes fluorescentes (IRDye, Alexa Fluor) para fluorescência
Para detecção multiplex, use anticorpos secundários com diferentes comprimentos de onda de emissão

Diretrizes de Diluição:

HRP-conjugated: Conjugado com HRP: 1:5000 a 1:10000 em solução de bloqueio

Fluorescent: Marcado fluorescentemente: Siga as recomendações do fabricante, tipicamente 1:5000 a 1:15000

Optimization: Comece com a recomendação do fabricante, depois otimize. Concentração muito alta causa alto fundo.

Exemplo de cálculo: Para diluição 1:5000, adicione 1 μL de anticorpo secundário a 5 mL de solução de bloqueio. Para 1:10000, adicione 0,5 μL a 5 mL. Use uma micropipeta para volumes precisos. Misture suavemente por inversão ou pipetagem - evite vórtex, pois pode causar espuma.

Prepare diluição em solução de bloqueio (mesma usada para etapa de bloqueio). Calcule o volume necessário com base no tamanho da membrana: mini-gel (8 x 10 cm) requer 5-10 mL, membranas maiores podem precisar de 15-20 mL. Sempre prepare fresco - nunca reutilize soluções de anticorpo secundário, pois elas se degradam e causam alto fundo.

1
Preparar Solução de Anticorpo Secundário:Calcule o volume necessário (5-10 mL para mini-gel). Adicione volume apropriado de solução de bloqueio a um recipiente limpo. Usando uma micropipeta, adicione o volume calculado de estoque de anticorpo secundário. Para diluição 1:5000 em 5 mL: adicione 1 μL de anticorpo. Misture suavemente pipetando para cima e para baixo ou invertendo o recipiente 5-10 vezes. Não faça vórtex. Rotule o recipiente com nome do anticorpo, diluição e data.
2
Transferir Membrana para Solução de Anticorpo:Após lavar o anticorpo primário, escorra brevemente o excesso de TBST da membrana (não deixe secar). Coloque a membrana com o lado da proteína para cima na solução de anticorpo secundário. Certifique-se de que a membrana esteja completamente submersa. Para membranas pequenas, use uma bolsa selável ou recipiente. Para membranas maiores, use uma bandeja ou recipiente com solução suficiente para cobrir completamente. Remova quaisquer bolhas de ar batendo suavemente ou usando pinças.
3
Incubar com Agitação Suave:Coloque o recipiente em um balanço ou agitador ajustado para velocidade suave (20-30 rpm). Incube à temperatura ambiente (20-25°C) por 1 hora. Se usar anticorpos fluorescentes, envolva o recipiente em papel alumínio ou coloque em caixa escura para proteger da luz. Monitore a temperatura - evite superaquecimento que pode aumentar o fundo. Não estenda a incubação além de 1,5 horas, pois isso aumenta o fundo sem melhorar o sinal.
4
Remover Membrana e Prosseguir para Lavagem:Após a incubação, remova cuidadosamente a membrana da solução de anticorpo usando pinças limpas. Escorra o excesso de solução tocando a borda em papel toalha. Não deixe a membrana secar. Imediatamente prossiga para as etapas de lavagem. Descarte a solução de anticorpo secundário - não reutilize, pois ela se degrada e causa alto fundo em usos subsequentes.

Tips:

Sempre prepare anticorpo secundário fresco - não reutilize soluções
Proteja anticorpos fluorescentes da luz durante e após a incubação
Use anticorpos secundários específicos da espécie para evitar reatividade cruzada
Incube à temperatura ambiente - incubação a 4°C não é necessária e pode reduzir o sinal
Certifique-se de cobertura completa - solução insuficiente causa coloração desigual
Não estenda o tempo de incubação desnecessariamente - incubação mais longa aumenta o fundo sem melhorar o sinal
Use agitação suave - agitação muito vigorosa pode danificar a membrana ou causar ligação desigual

Lavagem - Protocolo Detalhado

Lavagem completa remove anticorpos não ligados e reduz o sinal de fundo.

A lavagem adequada é crítica para remover anticorpos primários e secundários não ligados, o que reduz significativamente o sinal de fundo e melhora a relação sinal-ruído. A lavagem deve ser completa, mas não excessiva, pois lavagem excessiva pode reduzir o sinal específico. Use TBST fresco para cada lavagem e certifique-se de volume adequado para cobrir completamente a membrana.

Materiais Necessários:

TBST (solução salina tamponada com Tris e 0,1% Tween-20)
TBS (solução salina tamponada com Tris sem Tween-20) - opcional para lavagem final
Recipiente ou bandeja de lavagem
Plataforma de balanço ou agitador
TBST fresco para cada lavagem (tipicamente 20-50 mL por lavagem para mini-gel)

Após Incubação com Anticorpo Primário:

1
Primeira Lavagem:Remova a membrana da solução de anticorpo primário usando pinças limpas. Escorra o excesso de solução de anticorpo tocando a borda em papel toalha. Imediatamente coloque a membrana em TBST fresco (20-50 mL para mini-gel). Certifique-se de que a membrana esteja completamente submersa. Coloque em balanço em velocidade suave (20-30 rpm) por 5 minutos à temperatura ambiente.
2
Lavagens Subsequentes:Despeje completamente o TBST usado. Adicione TBST fresco (20-50 mL). Continue lavando por 5 minutos com agitação suave. Repita este processo 3-5 vezes no total (4-6 lavagens incluindo a primeira lavagem). Para a maioria das aplicações, 4-5 lavagens de 5 minutos cada é suficiente.
3
Verificação Final da Lavagem Primária:Após a lavagem final, escorra brevemente o excesso de TBST. A membrana deve estar pronta para incubação com anticorpo secundário. Não deixe a membrana secar entre lavagens ou antes da adição do anticorpo secundário.

Tips:

Sempre use TBST fresco para cada lavagem - reutilizar buffer de lavagem reduz a eficácia
Certifique-se de volume adequado - a membrana deve flutuar livremente, não grudar no recipiente
Mantenha agitação suave - agitação muito vigorosa pode danificar a membrana
Não estenda o tempo de lavagem desnecessariamente - 5 minutos por lavagem é padrão

Após Incubação com Anticorpo Secundário:

1
Lavagens Iniciais:Remova a membrana da solução de anticorpo secundário. Escorra o excesso de solução. Coloque em TBST fresco (20-50 mL). Lave 3-5 vezes por 5 minutos cada com agitação suave, trocando TBST entre cada lavagem. Isso remove o anticorpo secundário não ligado.
2
Lavagens Estendidas para Alto Fundo:Se o fundo estiver alto, aumente para 5-7 lavagens de 10 minutos cada. Alternativamente, adicione 0,1% de SDS ao TBST (adicione 100 μL de SDS 10% a 100 mL de TBST) para lavagem mais rigorosa. SDS ajuda a remover anticorpos ligados não especificamente.
3
Enxágue Final (Opcional):Para detecção quimioluminescente, realize um enxágue final rápido (30 segundos a 1 minuto) com TBS (sem Tween-20). Isso remove Tween-20 residual que pode interferir com alguns substratos ECL. Escorra o excesso de TBS antes de prosseguir para detecção.

Tips:

Lavagens de anticorpo secundário são mais críticas - anticorpo secundário não ligado causa alto fundo
Monitore o fundo durante a lavagem - se ainda estiver alto após 5 lavagens, estenda a lavagem
Para detecção fluorescente, enxágue final com TBS geralmente não é necessário
Não lave excessivamente - lavagem excessiva pode reduzir o sinal específico

Otimização de Lavagem:

Se o Fundo Estiver Alto:

Aumente o número de lavagens: 5-7 lavagens em vez de 3-5
Aumente a duração da lavagem: 10 minutos por lavagem em vez de 5 minutos
Adicione 0,1% de SDS ao buffer de lavagem: Prepare TBST com 0,1% de SDS (adicione 100 μL de SDS 10% por 100 mL de TBST)
Use TBS para lavagens finais: Substitua TBST por TBS (sem Tween-20) para as últimas 2-3 lavagens
Aumente o volume de lavagem: Use 50-100 mL por lavagem em vez de 20-50 mL
Verifique as concentrações de anticorpos: Alto fundo pode indicar que a concentração de anticorpo está muito alta

Se o Sinal Ficar Fraco Após Lavagem:

Reduza o número de lavagens: Tente 3 lavagens em vez de 5
Reduza a duração da lavagem: Tente 3 minutos por lavagem em vez de 5 minutos
Verifique a ligação de anticorpos: Sinal fraco pode indicar ligação ruim do anticorpo primário - verifique com controle positivo
Verifique se o anticorpo não está sendo lavado: Alguns anticorpos têm ligação mais fraca - reduza a rigidez da lavagem
Verifique os reagentes de detecção: Certifique-se de que o substrato ECL ou reagentes de detecção fluorescente estão frescos e funcionando

Métodos de Detecção

Escolha o método de detecção com base no seu equipamento e requisitos de sensibilidade. Cada método tem vantagens e protocolos específicos.

Detecção Quimioluminescente - Protocolo Detalhado

Método mais sensível, amplamente usado. Requer substrato ECL e filme de raios-X ou sistema de imagem. Fornece excelente sensibilidade e faixa dinâmica.

1
Preparar Substrato ECL:Misture os componentes do substrato ECL de acordo com as instruções do fabricante. A maioria dos kits ECL tem dois componentes (luminol e peróxido) que são misturados 1:1 logo antes do uso. Misture volumes iguais e use imediatamente.
2
Incubar Membrana:Coloque a membrana com o lado da proteína para cima em uma superfície limpa. Pipete o substrato ECL sobre a membrana, garantindo cobertura completa. Incube por 1-5 minutos à temperatura ambiente. Incubação mais longa (até 5 minutos) pode aumentar o sinal, mas também pode aumentar o fundo.
3
Remover Substrato em Excesso:Escorra o excesso de substrato inclinando a membrana. Não deixe a membrana secar. Envolva em filme plástico ou coloque em cassete de imagem. Certifique-se de que não há bolhas de ar entre a membrana e o filme.
4
Captura de Imagem:Para filme de raios-X: Exponha o filme por 1 segundo a 10 minutos dependendo da força do sinal. Comece com exposição curta (1-5 segundos) e ajuste. Revele o filme de acordo com as instruções do fabricante. Para câmera CCD: Coloque no sistema de imagem e capture a imagem. Ajuste o tempo de exposição para evitar saturação.
5
Múltiplas Exposições:Faça múltiplas exposições em tempos diferentes para garantir que você capture tanto bandas fortes quanto fracas dentro da faixa linear. Documente o tempo de exposição para cada imagem.

Detecção Fluorescente - Protocolo Detalhado

Método quantitativo usando anticorpos secundários marcados fluorescentemente. Não precisa de filme, permite detecção multiplex com cores diferentes.

1
Seleção de Anticorpo Secundário:Use anticorpos secundários marcados fluorescentemente. Opções comuns: IRDye 680/800 (LI-COR), Alexa Fluor 488/555/647, ou conjugados DyLight. Escolha comprimentos de onda que não se sobreponham se detectar múltiplas proteínas.
2
Incubação:Incube com anticorpo secundário fluorescente conforme descrito na seção de incubação de anticorpos. Proteja da luz durante e após a incubação para prevenir fotodegradação.
3
Lavagem:Lave completamente com TBST conforme descrito. A lavagem final pode ser com TBS para reduzir fluorescência de fundo.
4
Digitalização:Digitalize a membrana com comprimento de onda de laser apropriado para seu fluoróforo. Para IRDye: canais de 680 nm e 800 nm. Para Alexa Fluor: use comprimento de onda de excitação apropriado. Ajuste a potência do laser e a resolução de digitalização para sinal ótimo.
5
Análise de Imagem:Use software de imagem para quantificar a intensidade das bandas. A maioria dos sistemas fornece ferramentas de quantificação integradas. Certifique-se de que todas as bandas estejam dentro da faixa de detecção linear.

Detecção Colorimétrica - Protocolo Detalhado

Método simples usando substratos cromogênicos que produzem bandas coloridas. Não precisa de equipamento especial, mas menos sensível do que outros métodos.

1
Preparar Substrato:Prepare o substrato cromogênico de acordo com as instruções do fabricante. DAB (3,3'-diaminobenzidina) produz bandas marrons. BCIP/NBT produz bandas roxas/azuis. TMB produz bandas azuis.
2
Incubar Membrana:Coloque a membrana na solução de substrato. Incube à temperatura ambiente com agitação suave. As bandas aparecerão dentro de 5-30 minutos dependendo da força do sinal.
3
Parar Reação:Pare a reação quando as bandas atingirem a intensidade desejada lavando com água ou solução de parada (se fornecida). Para DAB, pare com água. Para BCIP/NBT, pare com água quando as bandas estiverem visíveis.
4
Documentar Imediatamente:Documente os resultados imediatamente digitalizando ou fotografando. A cor pode desaparecer com o tempo, especialmente com alguns substratos.

Quantificação de Western Blot

Quantificação precisa requer métodos adequados de normalização e análise. Esta seção fornece protocolos detalhados para quantificar resultados de western blot.

Análise ImageJ (Gratuito, Código Aberto):

1
Abra a imagem no ImageJ (Arquivo > Abrir). Converta para escala de cinza de 8 bits ou 16 bits se necessário (Imagem > Tipo > 8 bits).
2
Desenhe um retângulo ao redor da primeira banda usando a ferramenta Retângulo. Vá para Analisar > Géis > Selecionar Primeira Pista (ou pressione '1').
3
Mova o retângulo para a próxima banda e pressione '2' para segunda pista. Repita para todas as bandas na pista.
4
Após selecionar todas as bandas na primeira pista, pressione '3' para mover para a próxima pista. Repita o processo de seleção.
5
Uma vez que todas as bandas estejam selecionadas, vá para Analisar > Géis > Plotar Pistas. Isso cria perfis de intensidade.
6
Use a ferramenta Varinha para selecionar picos e medir área sob a curva (densidade integrada).
7
Registre valores para cada banda. Calcule razões e normalize conforme descrito acima.

Dicas de Quantificação e Melhores Práticas

Certifique-se de que todas as amostras estejam dentro da faixa de detecção linear - bandas saturadas não podem ser quantificadas com precisão
Use o mesmo tempo de exposição para todas as amostras ao usar quimioluminescência - exposições diferentes tornam a comparação inválida
Inclua múltiplas réplicas biológicas (pelo menos n=3) - réplicas técnicas não são suficientes
Use análise estatística apropriada - consulte com bioestatístico se não tiver certeza
Documente todos os parâmetros de análise (tempo de exposição, configurações de software, método de normalização)
Valide que o controle de carregamento é apropriado para suas condições experimentais
Considere usar normalização de proteína total como alternativa ou complemento ao controle de carregamento
Esteja ciente de que mudanças de dobra podem ser subestimadas se o controle de carregamento variar entre condições
Para publicação, inclua imagens brutas e dados de quantificação em materiais suplementares

Guia de Solução de Problemas de Western Blot

Problemas comuns e soluções em experimentos de western blot.

Sem Sinal ou Sinal Fraco

Concentração de anticorpo primário muito baixa:

Aumente a concentração de anticorpo ou estenda o tempo de incubação

Proteína não transferida para a membrana:

Verifique a eficiência de transferência colorindo a membrana com Ponceau S. Otimize as condições de transferência.

Anticorpo não específico para o alvo:

Verifique a especificidade do anticorpo com controles positivos e negativos

Reagente de detecção expirado ou armazenado incorretamente:

Use reagentes de detecção frescos, armazene de acordo com as instruções do fabricante

Alto Fundo

Bloqueio insuficiente:

Aumente o tempo de bloqueio para 2 horas ou use concentração mais alta (10% de leite)

Concentração de anticorpo muito alta:

Dilua os anticorpos ainda mais, otimize através de titulação

Lavagem insuficiente:

Aumente o número e duração das lavagens, adicione 0,1% de SDS ao buffer de lavagem

Contaminação da membrana:

Use pinças limpas, evite tocar a membrana com as mãos nuas

Bandas Não Específicas

Reatividade cruzada de anticorpos:

Use anticorpo mais específico ou anticorpo secundário pré-adsorvido

Degradação de proteínas:

Use amostras frescas, adicione inibidores de protease

Desnaturação incompleta:

Certifique-se de que as amostras sejam aquecidas a 95°C por 5 minutos

Transferência Incompleta

Proteínas grandes (>100 kDa) não transferindo:

Estenda o tempo de transferência para 2-3 horas, reduza a concentração de metanol para 10%, adicione 0,1% de SDS ao buffer de transferência, ou use tensão mais baixa (70-80V) por mais tempo. Considere usar membrana com tamanho de poro de 0,2 μm.

Proteínas pequenas (<20 kDa) passando através da membrana:

Reduza o tempo de transferência para 30-45 minutos, aumente metanol para 25%, ou use membrana com tamanho de poro de 0,2 μm em vez de 0,45 μm. Verifique com coloração Ponceau S.

Transferência desigual através da membrana:

Certifique-se de bom contato entre gel e membrana, remova todas as bolhas de ar rolando com tubo de ensaio, verifique se a pilha de transferência está adequadamente montada, certifique-se de que o buffer esteja bem agitado durante a transferência

Estratégias de Otimização de Protocolo

Abordagem sistemática para otimizar protocolos de western blot para melhores resultados. Mude um parâmetro por vez e documente todas as mudanças. Este guia abrangente fornece estratégias baseadas em evidências para melhorar a relação sinal-ruído, melhorar a reprodutibilidade e alcançar resultados de qualidade para publicação.

Otimização de Amostras - Guia Detalhado

Otimize a preparação de amostras para garantir máximo rendimento e qualidade de proteínas. A otimização de amostras é a base do western blotting bem-sucedido - qualidade ruim de amostra não pode ser compensada por etapas posteriores.

Seleção de Buffer de Lise:

Buffer RIPA: Mais comum, bom para a maioria das proteínas, contém detergentes (NP-40, deoxicolato, SDS) para lise completa. Melhor para proteínas citoplasmáticas e nucleares. Pode ser muito rigoroso para algumas proteínas de membrana.
Buffer NP-40: Mais suave, bom para proteínas de membrana e complexos proteicos, menos desnaturante. Preserva interações proteína-proteína melhor do que RIPA.
Buffer Laemmli: Lise direta, não precisa de etapa de lise separada. Método mais rápido, mas pode não extrair todas as proteínas eficientemente.
Buffer Ureia/Tioureia: Para proteínas difíceis de solubilizar, especialmente proteínas de membrana. Requer ajuste cuidadoso de pH.
Teste diferentes buffers sistematicamente para encontrar o melhor para sua proteína

Comece com RIPA para a maioria das aplicações. Se o sinal estiver fraco ou a proteína parecer degradada, teste NP-40. Para proteínas de membrana, tente NP-40 primeiro. Para proteínas nucleares, pode precisar de condições mais rigorosas ou extração sequencial. Para proteínas fosforiladas, certifique-se de que inibidores de fosfatase estejam incluídos.

Concentração de Proteínas:

Carregamento típico: 20-50 μg de proteína total por poço para a maioria das aplicações
Para proteínas altamente expressas (por exemplo, actina, tubulina): 10-20 μg geralmente é suficiente
Para proteínas de baixa abundância (por exemplo, fatores de transcrição, quinases): 50-100 μg podem ser necessários
Para proteínas de muito baixa abundância: Até 150 μg, mas monitore para borrão e artefatos
Muita proteína (>100 μg) causa borrão, má resolução e pode saturar a detecção
Muito pouca proteína (<10 μg) pode não ser detectável, especialmente para alvos de baixa abundância

Comece com 30 μg como linha de base. Se o sinal estiver fraco, aumente para 50-75 μg. Se as bandas estiverem borradas ou a resolução estiver ruim, diminua para 20-25 μg. Para comparações quantitativas, certifique-se de que todas as amostras tenham concentrações idênticas de proteínas. Use ensaio BCA ou Bradford para quantificação precisa - não estime.

Proporção de Buffer de Amostra:

Padrão: 3 partes de amostra para 1 parte de buffer de amostra 4X (concentração final 1X)
Para amostras concentradas (>10 mg/mL): Pode precisar diluir a amostra antes de adicionar buffer para evitar sobre-concentração
Para amostras diluídas (<1 mg/mL): Pode precisar concentrar antes de adicionar buffer, ou usar buffer de amostra 2X
Certifique-se de que a concentração final de SDS seja adequada (0,1-0,2%) para desnaturação adequada
Concentração final de glicerol (5-10%) ajuda as amostras a afundarem nos poços

Se as bandas não estiverem nítidas ou as proteínas parecerem agregadas, aumente a proporção de buffer de amostra ou certifique-se de aquecimento adequado. Se as amostras estiverem muito viscosas, dilua apropriadamente. Sempre adicione agente redutor fresco (2-ME ou DTT) logo antes do aquecimento.

Condições de Aquecimento:

Padrão: 95°C por 5 minutos - funciona para a maioria das proteínas, garante desnaturação completa
Alternativa: 70°C por 10 minutos - mais suave, para proteínas sensíveis à temperatura que agregam a 95°C
Algumas proteínas podem agregar em alta temperatura - teste 60°C, 70°C, 80°C, 95°C para encontrar ótimo
Para proteínas de membrana: Às vezes 37°C por 30 minutos funciona melhor do que alta temperatura
Nunca pule o aquecimento - desnaturação incompleta causa má migração e artefatos

Se você ver múltiplas bandas ou borrão que sugere agregação, teste temperaturas mais baixas. Se as bandas não estiverem nítidas ou a migração estiver inconsistente, certifique-se de que o aquecimento está completo (verifique se as amostras estão realmente na temperatura). Use bloco de aquecimento ou banho-maria - aquecimento em micro-ondas é inconsistente.

Adição de Inibidores:

Sempre adicione inibidores frescos logo antes do uso - eles degradam com o tempo
Inibidores de protease: PMSF (1 mM), ou coquetel comercial (siga instruções do fabricante)
Inibidores de fosfatase: NaF (10-50 mM), Na3VO4 (1-2 mM), ou coquetel comercial
Para proteínas fosforiladas: Inibidores de fosfatase são críticos - adicione ao buffer de lise imediatamente
Armazene estoques de inibidores adequadamente: PMSF em isopropanol, Na3VO4 em água, coquetéis conforme recomendado

Se você ver produtos de degradação (múltiplas bandas de menor peso molecular), aumente concentração de inibidor de protease ou tente inibidores diferentes. Se o sinal de fosforilação estiver fraco ou inconsistente, certifique-se de que inibidores de fosfatase estejam frescos e na concentração correta.

Otimização de Gel - Guia Detalhado

Otimize condições do gel para melhor separação de proteínas. A otimização do gel afeta diretamente a resolução, que determina sua capacidade de detectar proteínas específicas e distingui-las de bandas não específicas.

Otimização adequada do gel garante: (1) Separação ótima de proteínas com base no peso molecular, (2) Bandas nítidas e bem resolvidas, (3) Distância de migração apropriada para sua proteína-alvo, (4) Artefatos e borrão mínimos

Porcentagem do Gel:

A porcentagem do gel determina o tamanho do poro e afeta diretamente a migração de proteínas. A porcentagem ótima permite que sua proteína migre para o terço médio do gel de separação para melhor resolução.

Comece com gel de 10% (mais versátil, funciona para proteínas de 30-100 kDa). Para proteínas <20 kDa, aumente para 15-20% para melhor separação. Para proteínas >100 kDa, diminua para 6-8% para permitir migração. Teste diferentes porcentagens sistematicamente: prepare géis de 8%, 10%, 12%, 15% e execute a mesma amostra para comparar resolução.

Proteínas <20 kDa: Use géis de 15-20%. Porcentagem mais alta cria poros menores, fornecendo melhor separação para proteínas pequenas. Exemplo: Histonas, pequenos peptídeos, produtos de degradação.:

Proteínas 20-100 kDa: Use géis de 10-12%. Esta é a faixa mais comum. Exemplo: A maioria das proteínas de sinalização, fatores de transcrição, enzimas metabólicas.:

Proteínas 20-100 kDa: Use géis de 10-12%. Esta é a faixa mais comum. Exemplo: A maioria das proteínas de sinalização, fatores de transcrição, enzimas metabólicas.

Proteínas >100 kDa: Use géis de 6-8%. Porcentagem mais baixa cria poros maiores, permitindo que proteínas grandes migrem. Exemplo: Receptores, grandes fatores de transcrição, proteínas estruturais.:

Se o tamanho da proteína for desconhecido: Comece com 10%, ou use gel gradiente (4-20% ou 8-16%) para melhor chance de sucesso.:

Se o tamanho da proteína for desconhecido: Comece com 10%, ou use gel gradiente (4-20% ou 8-16%) para melhor chance de sucesso.

Prepare géis de 8%, 10%, 12% e 15%. Carregue amostras idênticas em cada um. Compare: (1) Nitidez das bandas, (2) Distância de migração (alvo deve estar no terço médio do gel), (3) Separação de outras bandas, (4) Resolução dos marcadores de peso molecular. Escolha a porcentagem que dá melhor resolução para seu alvo.

Géis Gradiente:

Géis gradiente fornecem tamanhos de poro variáveis através do gel, oferecendo melhor resolução para proteínas abrangendo amplas faixas de peso molecular.

Ao detectar múltiplas proteínas de tamanhos diferentes no mesmo gelQuando o tamanho da proteína é desconhecido ou pode variar (por exemplo, variantes de splicing)Ao otimizar nova proteína-alvoPara amostras complexas com muitas proteínas (por exemplo, lisados celulares completos)

Espessura do Gel:

A espessura do gel afeta a capacidade de proteínas, resolução e características de manuseio.

Comece com 1,0 mm para otimização. Se a resolução estiver ruim e você tiver amostra limitada, tente 0,75 mm. Se o sinal estiver fraco e você puder carregar mais, tente 1,5 mm.

1,0 mm: Espessura padrão, boa resolução, fácil de manusear, mais comumente usado (Capacidade padrão de proteínas (20-50 μg por poço típico)) - Recomendado para a maioria das aplicações, especialmente ao otimizar
1,5 mm: Mais capacidade de proteínas, pode carregar mais amostra se necessário (Maior capacidade de proteínas (pode carregar até 100 μg se necessário)) - Resolução ligeiramente menor, géis mais espessos rodam mais devagar - Quando você precisa carregar altas quantidades de proteínas (alvos de baixa abundância)
0,75 mm: Maior resolução, execução mais rápida, melhor para proteínas pequenas (Menor capacidade de proteínas (10-30 μg por poço típico)) - Mais frágil, mais difícil de manusear, requer carregamento cuidadoso - Para aplicações de alta resolução, proteínas pequenas, ou quando a amostra é limitada

Condições de Execução:

Tensão e tempo de execução afetam qualidade de separação, nitidez das bandas e artefatos potenciais.

Comece com 100V tensão constante como linha de base. Se as bandas estiverem borradas ou mostrarem 'sorriso' (migração curvada), reduza para 80V e execute por mais tempo. Se estiver rodando muito devagar e as bandas estiverem nítidas, pode aumentar para 120V, mas monitore a temperatura de perto. Para proteínas grandes (>100 kDa), sempre use tensão mais baixa (60-80V) para prevenir superaquecimento e melhorar transferência.

Qualidade de Preparação do Gel:

A qualidade da preparação do gel afeta diretamente a resolução e reprodutibilidade.

Problemas Comuns de Gel e Soluções:

Bandas estão borradas ou borradas:

Causes: Gel rodando muito rápido, Sobrecarga, Polimerização incompleta, Temperatura muito alta

Solutions: Reduza a tensão, diminua o carregamento de proteínas, certifique-se de polimerização completa, use resfriamento

Bandas migram desigualmente (efeito sorriso):

Causes: Gel não nivelado, Níveis de buffer desiguais, Gradiente de temperatura, Variação de espessura do gel

Solutions: Nivele o aparelho do gel, certifique-se de níveis de buffer uniformes, mantenha temperatura consistente, verifique espessura do gel

Má resolução:

Causes: Porcentagem de gel errada, Polimerização incompleta, Rodando muito rápido, Gel muito antigo

Solutions: Teste diferentes porcentagens de gel, certifique-se de polimerização completa, reduza a tensão, use gel fresco

Otimização de Transferência - Guia Detalhado