포괄적인 웨스턴 블롯 프로토콜

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적절한 샘플 준비는 성공적인 웨스턴 블롯에 중요합니다. 이 섹션은 단계별 지침과 함께 다양한 소스에서 샘플을 준비하는 상세한 방법을 다룹니다.

세포 용해물 준비

배양된 세포에서 단백질 용해물을 준비하는 상세한 프로토콜. 적절한 용해 조건은 단백질 무결성을 유지하고 분해를 방지하는 데 필수적입니다.

1
배지 medium을 제거하고 얼음처럼 차가운 PBS(인산 완충 식염수)로 세포를 2-3회 세척합니다. 용해 버퍼의 희석을 피하기 위해 모든 PBS가 완전히 제거되었는지 확인하세요. 부착 세포의 경우 접시에 PBS를 직접 추가합니다. 현탁 세포의 경우 500-1000 × g에서 5분간 원심분리하여 세포를 펠렛으로 만듭니다.
2
신선한 용해 버퍼를 준비하거나 -20°C에 저장된 분할 버퍼를 사용합니다. 사용 직전에 프로테아제 억제제(예: 최종 농도 1 mM의 PMSF 또는 상용 프로테아제 억제제 칵테일) 및 포스파타제 억제제(예: 10 mM NaF, 1 mM Na3VO4)를 추가합니다. 전체 과정 동안 버퍼를 얼음처럼 차갑게 유지하세요.
3
적절한 양의 용해 버퍼를 추가합니다(일반적으로 10^6 세포당 100-200 μL 또는 배양 접시 cm²당 100-150 μL). 부착 세포의 경우 세포 스크래퍼를 사용하여 용해 버퍼에서 직접 세포를 긁어냅니다. 현탁 세포의 경우 용해 버퍼에 펠렛을 재현탁합니다. 사전에 냉각된 원심분리 튜브로 옮깁니다.
4
얼음 위에서 20-30분간 배양하며 5-10분마다 가끔 부드럽게 보텍싱합니다. 용해하기 어려운 세포의 경우 배양 시간을 45분까지 연장하거나 초음파 처리를 수행할 수 있습니다(얼음 위에서 각각 10초씩 3-5회 펄스).
5
4°C에서 12,000-14,000 × g로 15분간 원심분리합니다. 이것은 세포 파편, 핵 및 불용성 물질을 제거합니다. 일부 응용의 경우 더 높은 속도(20,000 × g)에서 원심분리하거나 순차적 원심분리를 수행해야 할 수 있습니다.
6
펠렛을 방해하지 않고 조심스럽게 상층액을 수집합니다. 새로운 사전 냉각된 튜브로 옮깁니다. 전기영동을 방해할 수 있는 불용성 응집체를 포함할 수 있으므로 펠렛 물질을 수집하지 마세요.
7
BCA, Bradford 또는 Lowry 분석을 사용하여 단백질 농도를 결정합니다. 항상 BSA 표준을 사용하여 표준 곡선을 준비하세요. 필요하면 샘플을 희석하여 분석의 선형 범위 내에 있도록 합니다. 세포 용해물의 일반적인 농도 범위는 1-10 mg/mL입니다.

Tips:

단백질 분해를 방지하기 위해 빠르게 작업하고 모든 것을 얼음 위에 보관하세요
시간이 지나면서 분해되므로 신선한 프로테아제 억제제를 사용하세요
인산화된 단백질의 경우 포스파타제 억제제가 필수적입니다
거품과 단백질 변성을 일으킬 수 있는 과도한 보텍싱을 피하세요
즉시 사용하지 않으면 -80°C에 용해물을 저장하세요

조직 샘플 준비

조직 샘플에서 단백질 추출물을 준비하는 프로토콜. 조직 균질화는 세포 용해보다 더 강력한 방법이 필요합니다.

1
신선한 조직을 수집하고 즉시 얼음 위에 놓거나 액체 질소로 급속 동결합니다. 동결된 조직의 경우 처리할 때까지 동결 상태를 유지하세요. 차가운 표면에서 메스 또는 면도날을 사용하여 조직을 작은 조각(2-3 mm³)으로 자릅니다.
2
얼음처럼 차가운 용해 버퍼에서 조직을 균질화합니다(일반적으로 조직 무게당 버퍼 10-20 부피, 예: 1-2 mL 버퍼에 100 mg 조직). 기계적 균질화기, 막자사발 또는 비드 비팅 시스템을 사용하세요. 단단한 조직의 경우 냉각 간격을 두고 여러 번 짧게 버스트(각각 10-15초)로 균질화를 수행하세요.
3
얼음 위에서 30분간 가끔 보텍싱하면서 균질화물을 배양합니다. 섬유성 조직의 경우 배양 시간을 45-60분까지 연장하세요. 일부 조직은 짧은 초음파 처리(얼음 위에서 각각 5초씩 3-5회 펄스)로 이점을 얻을 수 있습니다.
4
4°C에서 12,000-14,000 × g로 20분간 원심분리합니다. 높은 지질 함량을 가진 조직의 경우 더 높은 속도에서 원심분리하거나 추가 원심분리 단계를 수행해야 할 수 있습니다.
5
상층액에 보이는 파편이 포함되어 있거나 탁한 경우 0.45 μm 주사기 필터를 통해 여과하거나 다시 원심분리하세요. 일부 프로토콜은 거즈 또는 미세 메쉬를 통해 여과하는 것을 권장합니다.
6
단백질 농도를 결정합니다. 조직 추출물은 일반적으로 세포 용해물보다 높은 단백질 농도(5-20 mg/mL)를 가집니다. 정량 분석에 필요에 따라 희석하세요.

Tips:

단백질 분해를 방지하기 위해 처리할 때까지 조직을 동결 상태로 유지하세요
조직 유형에 적합한 균질화 방법을 사용하세요
일부 조직은 지질 또는 결합 조직을 제거하기 위한 추가 단계가 필요할 수 있습니다
동결-해동 주기를 피하기 위해 분할하여 -80°C에 추출물을 저장하세요

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단백질 정량화

정확한 단백질 정량화는 동일한 양의 단백질을 로드하는 데 필수적입니다. 제조업체의 지침에 따라 BCA, Bradford 또는 Lowry 분석을 사용하세요. 정확한 정량화를 위해 항상 표준 곡선을 준비하세요.

SDS-PAGE 전기영동

SDS-PAGE는 분자량에 따라 단백질을 분리합니다. 적절한 겔 준비 및 실행 조건은 분해능에 중요합니다. 이 섹션은 SDS-PAGE 겔을 준비하고 실행하는 상세한 단계별 지침을 제공합니다.

필요한 재료:

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30% 아크릴아미드/Bis 용액 (29:1 또는 37.5:1 비율)
1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 (분리 겔용)
0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 (적층 겔용)
10% SDS (도데실 황산나트륨)
10% APS (과황산암모늄) - 신선하게 준비
TEMED (N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌다이아민)
탈이온수
겔 주조 시스템 (유리판, 스페이서, 빗)
이소프로판올 또는 물로 포화된 부탄올 (오버레이용)

분리 겔 준비 (10% 예시):

1
부피 계산:10% 분리 겔(총 10 mL)의 경우: 3.3 mL 30% 아크릴아미드, 2.5 mL 1.5 M Tris-HCl pH 8.8, 0.1 mL 10% SDS, 4.05 mL 탈이온수를 혼합합니다. 진공 하에서 10-15분간 탈기하여 용존 산소를 제거합니다.
2
중합제 추가:50 μL 10% APS와 10 μL TEMED를 추가합니다. 부드럽게 회전시켜 혼합합니다(거품이 생기므로 보텍싱하지 마세요). 즉시 겔 카세트에 약 1 cm 아래(빗이 위치할 곳)까지 부어 넣습니다.
3
오버레이:산소 접촉을 방지하고 평평한 겔 표면을 만들기 위해 이소프로판올 또는 물로 포화된 부탄올을 조심스럽게 오버레이합니다. 실온에서 30-45분간 중합시킵니다. 중합이 완료되면 명확한 계면이 보입니다.
4
오버레이 제거:오버레이를 버리고 탈이온수로 겔 상단을 세척합니다. 필터 종이로 상단 표면을 말리되, 겔을 만지지 않도록 주의하세요.

겔 백분율 가이드라인:

6-8%: >100 kDa 단백질용 (큰 단백질)
10%: 30-100 kDa 단백질용 (가장 일반적, 다용도)
12%: 15-60 kDa 단백질용
15%: 10-40 kDa 단백질용
18-20%: <20 kDa 단백질용 (작은 단백질)

적층 겔 준비 (5%):

1
적층 겔 용액 준비:5% 적층 겔(총 4 mL)의 경우: 0.67 mL 30% 아크릴아미드, 1.0 mL 0.5 M Tris-HCl pH 6.8, 0.04 mL 10% SDS, 2.25 mL 탈이온수를 혼합합니다. 시간이 허락하면 탈기하세요.
2
중합제 추가:25 μL 10% APS와 5 μL TEMED를 추가합니다. 부드럽게 혼합하고 즉시 분리 겔 위에 부어 넣습니다.
3
빗 삽입:거품을 피하기 위해 빗을 각도로 빠르게 삽입한 다음 곧게 만듭니다. 20-30분간 중합시킵니다. 빗 이빨에 명확한 선이 보이면 겔이 준비된 것입니다.
4
빗 제거:조심스럽게 빗을 제거하고 실행 버퍼 또는 탈이온수로 웰을 세척하여 중합되지 않은 아크릴아미드를 제거합니다. 이제 겔이 샘플 로딩 준비가 되었습니다.

샘플 로딩:

1
웰당 20-50 μg 단백질로 Laemmli 샘플 버퍼(최종 농도 1X)에 샘플을 준비합니다. 높게 발현된 단백질의 경우 10-20 μg를 사용하세요. 낮은 풍부도의 단백질의 경우 50-100 μg가 필요할 수 있습니다.
2
최소한 하나의 웰에 분자량 마커를 포함하세요. 사전 염색된 마커를 사용하면 전기영동 중 진행 상황을 모니터링할 수 있습니다.
3
피펫을 사용하여 거품을 피하면서 조심스럽게 샘플을 로드합니다. 샘플이 인접한 웰로 넘치지 않도록 천천히 로드하세요.
4
균일한 전류 분배를 보장하기 위해 빈 웰을 1X 샘플 버퍼로 채웁니다.

더 나은 분해능을 위한 팁

겔 중합을 위해 신선한 APS와 TEMED를 사용하세요 - 오래된 시약은 제대로 작동하지 않을 수 있습니다
겔 구조를 방해할 수 있는 거품을 방지하기 위해 APS를 추가하기 전에 겔 용액을 탈기하세요
사용하기 전에 겔이 완전히 중합되도록 하세요 - 불완전한 중합은 분해능 저하를 일으킵니다
단백질 크기에 적합한 겔 백분율을 사용하세요 - 잘못된 백분율은 분리 저하를 초래합니다
전기영동 중 일정한 온도를 유지하세요 - 온도 변동은 이동에 영향을 줍니다
버퍼 수준이 충분한지 확인하세요 - 낮은 버퍼는 불균일한 실행을 일으킵니다
신선한 실행 버퍼를 사용하세요 - 오래된 버퍼는 잘못된 pH 또는 전도도를 가질 수 있습니다
샘플 과부하를 피하세요 - 너무 많은 단백질은 밴드 번짐을 일으킵니다
가능하면 동일한 부피를 로드하세요 - 다른 부피는 레인 왜곡을 일으킬 수 있습니다

단백질 전사 방법

겔에서 멤브레인으로 단백질을 전사하는 것은 검출 감도를 결정하는 중요한 단계입니다. 이 섹션은 다양한 전사 방법에 대한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

PVDF 멤브레인 (권장):

1
멤브레인을 크기에 맞게 자릅니다 (겔보다 약간 크게)
2
100% 메탄올에 30초간 담가 멤브레인을 활성화합니다
3
전사 버퍼로 옮기고 5분간 평형화합니다
4
PVDF 멤브레인은 니트로셀룰로스보다 더 나은 단백질 결합 능력과 내구성을 가집니다

습식 전사 - 상세 프로토콜

가장 일반적으로 사용되는 방법으로, 모든 크기의 단백질에 대해 우수한 전사 효율을 제공합니다. 큰 단백질(>100 kDa)에 가장 적합합니다.

필요한 재료:

전사 버퍼 (PVDF용 25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% methanol)
PVDF 또는 니트로셀룰로스 멤브레인
여과지 (Whatman 3MM 또는 동등품)
전사 스펀지 또는 패드
전사 카세트
냉각 시스템이 있는 전사 탱크
얼음 또는 냉각 팩

1
겔 평형화:전기영동 후, 조심스럽게 플레이트에서 겔을 제거합니다. 전사 버퍼에서 겔을 15-30분간 평형화합니다. 이것은 과량의 SDS를 제거하고 전사 효율을 개선합니다. 평형화 중 부드럽게 흔들어주세요.
2
멤브레인 준비:PVDF의 경우: 크기에 맞게 자르고, 100% 메탄올에 30초간 담가 활성화한 다음, 전사 버퍼에서 5분간 평형화합니다. 니트로셀룰로스의 경우: 크기에 맞게 자르고 전사 버퍼에 직접 5분간 적십니다.
3
전사 스택 조립:전사 버퍼로 채워진 트레이에서 전사 스택을 조립합니다. 음극(검은색, 음극)에서 양극(빨간색, 양극)으로: (1) 스펀지, (2) 여과지 3장, (3) 겔(면이 아래로), (4) 멤브레인(겔 위에), (5) 여과지 3장, (6) 스펀지. 테스트 튜브로 굴리거나 롤러를 사용하여 모든 공기 거품을 제거하세요. 공기 거품은 해당 위치에서 단백질 전사를 방지합니다.
4
전사 조건:차가운 전사 버퍼로 채워진 전사 탱크에 카세트를 놓습니다. 버퍼가 카세트를 덮는지 확인하세요. 표준 전사의 경우: 4°C에서 100V로 1시간(얼음 또는 냉각 시스템 사용). 큰 단백질의 경우: 70-80V로 2-3시간. 밤새 전사의 경우: 4°C에서 30V로 밤새. 전사 중 버퍼가 차갑고 잘 교반되는지 확인하세요.
5
전사 검증:전사 후, Ponceau S(5% 아세트산에 0.1%)로 멤브레인을 2-5분간 염색하여 효율을 검증합니다. 물로 세척하여 단백질 밴드를 시각화합니다. 이것은 차단으로 진행하기 전에 성공적인 전사를 확인합니다. Ponceau S는 차단 전에 TBST로 세척할 수 있습니다.

반건식 전사 - 상세 프로토콜

최소한의 버퍼를 사용하는 더 빠른 방법. 작은 단백질부터 중간 크기 단백질(<100 kDa)에 적합합니다. 큰 단백질에는 덜 효율적입니다.

1
버퍼 준비:양극 버퍼 준비: 0.3 M Tris, 20% methanol, pH 10.4. 음극 버퍼 준비: 25 mM Tris, 40 mM glycine, 10% methanol, 0.01% SDS, pH 9.4. 각 버퍼에 여과지 3장을 담급니다.
2
양극에서 스택 조립:양극 플레이트에서: 양극 버퍼에 담근 여과지 3장을 놓습니다. 활성화된 PVDF 멤브레인을 위에 놓습니다(또는 적신 니트로셀룰로스). 굴려서 공기 거품을 제거하세요.
3
겔 배치:평형화된 겔을 조심스럽게 멤브레인 위에 놓습니다. 좋은 접촉을 보장하고 굴려서 모든 공기 거품을 제거하세요.
4
스택 완성:음극 버퍼에 담근 여과지 3장을 겔 위에 놓습니다. 공기 거품을 제거하세요. 전사 장치를 닫습니다.
5
전사:일정한 전류 적용: 겔 면적 cm²당 0.8-1.2 mA. 표준 미니 겔(8 x 10 cm)의 경우 15V로 30-60분 사용합니다. 온도를 모니터링하세요 - 반건식 전사는 과열될 수 있습니다. 온도가 30°C를 초과하면 냉각을 사용하세요.

차단 및 항체 배양

적절한 차단 및 항체 조건은 낮은 배경으로 특이적 검출에 필수적입니다. 이 섹션은 각 단계에 대한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

차단 - 상세 프로토콜

차단은 항체의 멤브레인에 대한 비특이적 결합을 방지하여 배경 신호를 감소시킵니다.

Blocking Solutions:

TBST에 5% 무지방 우유 (표준):

100 mL TBST에 5 g 무지방 분유를 용해합니다. 완전히 용해될 때까지 잘 혼합합니다. 용해되지 않은 입자를 제거하기 위해 거즈를 통해 여과해야 할 수 있습니다. 신선하게 준비하거나 4°C에 최대 1주일 보관합니다. 사용 전에 잘 흔들어주세요.

Applications: 대부분의 일반적인 응용, 비용 효율적, 대부분의 항체에 잘 작동

Limitations: 인산 특이적 항체를 방해할 수 있는 카제인을 포함하며, 일부 항체에 높은 배경을 일으킬 수 있습니다

TBST에 3-5% BSA (인산화된 단백질용):

100 mL TBST에 3-5 g BSA(소 혈청 알부민, Fraction V)를 용해합니다. 거품을 피하기 위해 부드럽게 혼합합니다. 필요하면 0.45 μm 필터를 통해 여과합니다. 4°C에 보관합니다. 1주일 이내에 사용하세요.

Applications: 인산화된 단백질, 우유가 높은 배경을 일으킬 때, 일부 민감한 항체

Advantages: 카제인 간섭 없음, 인산 항체에 낮은 배경, 더 일관적

1
차단 용액 준비:차단 용액을 신선하게 준비하거나 저장된 용액을 사용하세요(유통기한 확인). 5% 우유의 경우: 100 mL TBST에 5 g 무지방 분유를 용해합니다. 완전히 용해될 때까지(5-10분) 회전시키거나 부드럽게 뒤집어 잘 혼합합니다. 입자가 남아 있으면 거즈 또는 0.45 μm 필터를 통해 여과하세요. BSA의 경우: 100 mL TBST에 3-5 g BSA를 용해하고, 거품을 피하기 위해 부드럽게 혼합합니다. 즉시 사용하지 않으면 4°C에 보관하세요.
2
Ponceau S 염색 제거 (선택사항):Ponceau S 염색으로 전사를 검증한 경우, 염색을 제거하기 위해 TBST로 멤브레인을 간단히 세척합니다(빠른 세척 2-3회, 각 30초). 이 단계는 선택사항입니다 - Ponceau S는 후속 세척 중 제거되므로 그대로 둘 수 있습니다. 과량의 TBST를 배수하되 멤브레인이 마르지 않도록 하세요.
3
멤브레인을 차단 용액으로 옮기기:멤브레인을 단백질 면이 위로 오도록 차단 용액에 놓습니다. 멤브레인을 완전히 덮을 수 있는 충분한 부피를 사용하세요: 미니 겔(8 x 10 cm)은 10-20 mL가 필요하며, 더 큰 멤브레인은 30-50 mL가 필요할 수 있습니다. 멤브레인이 자유롭게 떠다니고 완전히 잠기도록 하세요. 부드럽게 두드리거나 핀셋을 사용하여 공기 거품을 제거하세요.
4
부드러운 교반으로 배양:컨테이너를 부드러운 속도(20-30 rpm)로 설정된 로커 또는 셰이커에 놓습니다. 실온(20-25°C)에서 1시간 동안 배양합니다. 높은 배경 문제의 경우 2시간까지 연장하거나 더 높은 농도(10% 우유)를 사용하세요. 또는 편리한 경우 4°C에서 밤새(12-16시간) 차단할 수 있습니다 - 이것은 일부 응용에 대해 차단 효율을 개선할 수 있습니다.
5
1차 항체로 진행:차단 후 멤브레인을 세척하지 마세요. 가장자리를 종이 타월에 닿게 하여 과량의 차단 용액을 배수하되, 멤브레인이 마르지 않도록 하세요. 1차 항체를 희석하는 데 사용한 것과 동일한 유형의 차단 용액(우유 또는 BSA)을 사용하여 즉시 1차 항체 배양으로 진행하세요.

Tips:

멤브레인이 차단 용액에 완전히 잠기도록 하세요 - 불충분한 커버리지는 높은 배경을 일으킵니다
부드러운 흔들기 또는 로킹(20-30 rpm)을 사용하세요 - 너무 격렬한 흔들기는 멤브레인을 손상시키거나 불균일한 차단을 일으킬 수 있습니다
편리한 경우 4°C에서 밤새 차단할 수 있습니다 - 이것은 차단 효율을 개선할 수 있습니다
인산화된 단백질의 경우 항상 우유가 아닌 BSA를 사용하세요 - 우유는 인산 특이적 항체를 방해하는 카제인을 포함합니다
가능하면 신선한 차단 용액을 준비하세요 - 저장된 용액은 효과를 잃을 수 있습니다
충분한 부피를 사용하세요 - 멤브레인이 자유롭게 떠다니고 컨테이너 벽에 달라붙지 않아야 합니다
차단 용액을 재사용하지 마세요 - 전사된 단백질이나 오염물질을 포함할 수 있습니다

1차 항체 배양 - 상세 프로토콜

1차 항체는 표적 단백질에 특이적으로 결합합니다. 적절한 희석 및 배양 조건이 중요합니다.

항체 희석:

단클론 항체: 차단 용액에서 일반적으로 1:1000 ~ 1:5000
다클론 항체: 차단 용액에서 일반적으로 1:500 ~ 1:2000
제조업체의 권장 희석으로 시작한 다음, 적정을 통해 최적화하세요
차단 용액(차단에 사용한 것과 동일한 용액)에서 항체를 희석하세요

Optimization: 신호가 약한 경우: 농도를 증가시키거나 배양을 연장하세요. 배경이 높은 경우: 농도를 감소시키거나 차단 시간을 증가시키세요.

배양 조건:

4°C에서 밤새 (권장)

최상의 신호 대 잡음비, 가장 민감한 검출. 부드러운 흔들기 또는 로킹으로 냉실 또는 냉장고에서 배양합니다.

Duration: 12-16시간

Advantages: 더 높은 감도, 더 나은 신호 대 잡음비, 편리한 타이밍

실온

더 빠른 방법, 밤새가 불가능할 때 적합합니다.

Duration: 부드러운 흔들기로 1-2시간

Advantages: 더 빠름, 당일 결과에 편리

Limitations: 약간 높은 배경을 가질 수 있으며, 밤새보다 덜 민감함

Volume: 멤브레인을 덮을 수 있는 충분한 부피를 사용하세요(미니 겔의 경우 일반적으로 5-10 mL). 보존제(0.02% 아지드나트륨)와 함께 4°C에서 적절히 저장하면 항체 용액을 2-3회 재사용할 수 있습니다.

1
항체 희석 계산 및 준비:멤브레인 크기에 따라 필요한 부피를 결정합니다: 미니 겔(8 x 10 cm)은 5-10 mL가 필요하며, 더 큰 멤브레인은 15-20 mL가 필요합니다. 필요한 항체 부피를 계산하세요. 예: 5 mL에서 1:1000 희석의 경우, 5 mL 차단 용액에 5 μL 1차 항체 원액을 추가합니다. 정확한 부피를 위해 마이크로피펫을 사용하세요. 위아래로 피펫팅하거나 컨테이너를 5-10회 뒤집어 부드럽게 혼합하세요. 거품이나 변성을 일으킬 수 있으므로 보텍싱하지 마세요.
2
멤브레인을 항체 용액으로 옮기기:차단 후, 과량의 차단 용액을 배수하세요(멤브레인이 마르지 않도록). 멤브레인을 단백질 면이 위로 오도록 1차 항체 용액에 놓습니다. 멤브레인이 완전히 덮이고 잠기도록 하세요. 작은 멤브레인의 경우 밀봉 가능한 백(밀봉 전 공기 거품 제거) 또는 작은 컨테이너를 사용하세요. 더 큰 멤브레인의 경우 완전히 덮을 수 있는 충분한 용액이 있는 트레이 또는 컨테이너를 사용하세요. 항체 이름, 희석 및 날짜로 컨테이너에 라벨을 붙이세요.
3
선택한 온도에서 배양:밤새 배양(권장)의 경우: 부드러운 흔들기 또는 로킹(20-30 rpm)으로 냉실 또는 냉장고(4°C)에 12-16시간 동안 놓습니다. 증발을 방지하기 위해 컨테이너가 밀봉되었는지 확인하세요. 실온 배양의 경우: 부드러운 흔들기로 실온(20-25°C)에서 로커에 1-2시간 동안 놓습니다. 온도를 모니터링하세요 - 과열을 피하세요. 밤새 배양은 일반적으로 더 나은 신호 대 잡음비를 제공합니다.
4
항체 용액 저장 (선택사항):배양 후, 1차 항체 용액을 재사용을 위해 저장할 수 있습니다. 박테리아 성장을 방지하기 위해 0.02% 아지드나트륨을 추가합니다(5 mL 용액당 10% 아지드나트륨 10 μL 추가). 밀봉된 컨테이너에 4°C에 보관합니다. 항체 이름, 희석, 날짜 및 사용 횟수로 라벨을 붙이세요. 대부분의 항체는 2-3회 재사용할 수 있지만, 사용할 때마다 신호가 감소할 수 있습니다. 오염이 의심되면 폐기하세요.
5
멤브레인 제거 및 세척으로 진행:깨끗한 핀셋을 사용하여 항체 용액에서 멤브레인을 조심스럽게 제거합니다. 가장자리를 종이 타월에 닿게 하여 과량의 용액을 배수합니다. 멤브레인이 마르지 않도록 하세요. 즉시 세척 단계로 진행하세요. 이 시점 이전에 멤브레인을 세척하지 마세요 - 1차 항체 배양 전 세척은 필요하지 않으며 신호를 감소시킬 수 있습니다.

Tips:

항상 차단에 사용한 것과 동일한 차단 용액(우유 또는 BSA)에서 1차 항체를 희석하세요
충분한 부피를 사용하세요 - 불충분한 부피는 불균일한 결합과 높은 배경을 일으킵니다
최상의 신호 대 잡음비를 위해 4°C에서 밤새 배양을 권장합니다
빛에 민감한 항체를 사용하는 경우 빛으로부터 보호하세요
모든 컨테이너에 항체 정보를 명확하게 라벨하세요
과정 중 어느 시점에서도 멤브레인이 마르지 않도록 하세요
아지드나트륨과 함께 적절히 저장하면 1차 항체 용액을 2-3회 재사용할 수 있습니다

2차 항체 배양 - 상세 프로토콜

2차 항체는 검출 분자(HRP, 형광 염료)에 결합되어 있으며 1차 항체에 결합합니다.

2차 항체는 1차 항체를 인식하고 결합하여 결합된 효소(HRP) 또는 형광 태그를 통해 검출을 가능하게 합니다. 적절한 선택, 희석 및 배양 조건은 최적의 신호 대 잡음비에 중요합니다. 항상 종 특이적 2차 항체(토끼 1차 항체용 항토끼, 마우스 1차 항체용 항마우스)를 사용하고 각 실험에 신선한 용액을 준비하세요.

2차 항체 선택:

1차 항체의 종에 특이적이어야 합니다(예: 토끼 1차 항체용 항토끼, 마우스 1차 항체용 항마우스)
교차 반응성을 최소화하기 위해 고도로 교차 흡착된 2차 항체를 사용하세요
적절한 결합체를 선택하세요: 화학발광용 HRP, 형광용 형광 염료(IRDye, Alexa Fluor)
다중 검출의 경우, 다른 발광 파장을 가진 2차 항체를 사용하세요

희석 가이드라인:

HRP-conjugated: HRP 결합: 차단 용액에서 1:5000 ~ 1:10000

Fluorescent: 형광 표지: 제조업체의 권장사항을 따르세요, 일반적으로 1:5000 ~ 1:15000

Optimization: 제조업체의 권장사항으로 시작한 다음 최적화하세요. 농도가 너무 높으면 높은 배경을 일으킵니다.

계산 예시: 1:5000 희석의 경우, 5 mL 차단 용액에 1 μL 2차 항체를 추가합니다. 1:10000의 경우, 5 mL에 0.5 μL를 추가합니다. 정확한 부피를 위해 마이크로피펫을 사용하세요. 뒤집기 또는 피펫팅으로 부드럽게 혼합하세요 - 거품을 일으킬 수 있으므로 보텍싱을 피하세요.

차단 용액(차단 단계에 사용한 것과 동일)에서 희석을 준비하세요. 멤브레인 크기에 따라 필요한 부피를 계산하세요: 미니 겔(8 x 10 cm)은 5-10 mL가 필요하며, 더 큰 멤브레인은 15-20 mL가 필요할 수 있습니다. 항상 신선하게 준비하세요 - 2차 항체 용액은 분해되고 후속 사용에서 높은 배경을 일으키므로 재사용하지 마세요.

1
2차 항체 용액 준비:필요한 부피를 계산합니다(미니 겔의 경우 5-10 mL). 깨끗한 컨테이너에 적절한 부피의 차단 용액을 추가합니다. 마이크로피펫을 사용하여 계산된 부피의 2차 항체 원액을 추가합니다. 5 mL에서 1:5000 희석의 경우: 1 μL 항체를 추가합니다. 위아래로 피펫팅하거나 컨테이너를 5-10회 뒤집어 부드럽게 혼합하세요. 보텍싱하지 마세요. 항체 이름, 희석 및 날짜로 컨테이너에 라벨을 붙이세요.
2
멤브레인을 항체 용액으로 옮기기:1차 항체 세척 후, 멤브레인에서 과량의 TBST를 간단히 배수하세요(마르지 않도록). 멤브레인을 단백질 면이 위로 오도록 2차 항체 용액에 놓습니다. 멤브레인이 완전히 잠기도록 하세요. 작은 멤브레인의 경우 밀봉 가능한 백 또는 컨테이너를 사용하세요. 더 큰 멤브레인의 경우 완전히 덮을 수 있는 충분한 용액이 있는 트레이 또는 컨테이너를 사용하세요. 부드럽게 두드리거나 핀셋을 사용하여 공기 거품을 제거하세요.
3
부드러운 교반으로 배양:부드러운 속도(20-30 rpm)로 설정된 로커 또는 셰이커에 컨테이너를 놓습니다. 실온(20-25°C)에서 1시간 동안 배양합니다. 형광 항체를 사용하는 경우, 컨테이너를 알루미늄 호일로 감싸거나 어두운 상자에 놓아 빛으로부터 보호하세요. 온도를 모니터링하세요 - 배경을 증가시킬 수 있는 과열을 피하세요. 신호를 개선하지 않고 배경을 증가시키므로 배양을 1.5시간을 초과하지 마세요.
4
멤브레인 제거 및 세척으로 진행:배양 후, 깨끗한 핀셋을 사용하여 항체 용액에서 멤브레인을 조심스럽게 제거합니다. 가장자리를 종이 타월에 닿게 하여 과량의 용액을 배수합니다. 멤브레인이 마르지 않도록 하세요. 즉시 세척 단계로 진행하세요. 2차 항체 용액을 폐기하세요 - 분해되고 후속 사용에서 높은 배경을 일으키므로 재사용하지 마세요.

Tips:

항상 2차 항체를 신선하게 준비하세요 - 용액을 재사용하지 마세요
배양 중 및 배양 후 형광 항체를 빛으로부터 보호하세요
교차 반응성을 피하기 위해 종 특이적 2차 항체를 사용하세요
실온에서 배양하세요 - 4°C 배양은 필요하지 않으며 신호를 감소시킬 수 있습니다
완전한 커버리지를 보장하세요 - 불충분한 용액은 불균일한 염색을 일으킵니다
불필요하게 배양 시간을 연장하지 마세요 - 더 긴 배양은 신호를 개선하지 않고 배경을 증가시킵니다
부드러운 교반을 사용하세요 - 너무 격렬한 흔들기는 멤브레인을 손상시키거나 불균일한 결합을 일으킬 수 있습니다

세척 - 상세 프로토콜

철저한 세척은 결합되지 않은 항체를 제거하고 배경 신호를 감소시킵니다.

적절한 세척은 결합되지 않은 1차 및 2차 항체를 제거하는 데 중요하며, 이는 배경 신호를 크게 감소시키고 신호 대 잡음비를 개선합니다. 세척은 철저해야 하지만 과도하지 않아야 하며, 과도한 세척은 특이적 신호를 감소시킬 수 있습니다. 각 세척에 신선한 TBST를 사용하고 멤브레인을 완전히 덮을 수 있는 충분한 부피를 보장하세요.

필요한 재료:

TBST (0.1% Tween-20이 포함된 Tris 완충 식염수)
TBS (Tween-20이 없는 Tris 완충 식염수) - 최종 세척용 선택사항
세척 컨테이너 또는 트레이
로킹 플랫폼 또는 셰이커
각 세척에 신선한 TBST (미니 겔의 경우 일반적으로 세척당 20-50 mL)

1차 항체 배양 후:

1
첫 번째 세척:깨끗한 핀셋을 사용하여 1차 항체 용액에서 멤브레인을 제거합니다. 가장자리를 종이 타월에 닿게 하여 과량의 항체 용액을 배수합니다. 즉시 멤브레인을 신선한 TBST(미니 겔의 경우 20-50 mL)에 놓습니다. 멤브레인이 완전히 잠기도록 하세요. 실온에서 부드러운 속도(20-30 rpm)로 로커에 5분간 놓습니다.
2
후속 세척:사용한 TBST를 완전히 버립니다. 신선한 TBST(20-50 mL)를 추가합니다. 부드러운 흔들기로 5분간 계속 세척합니다. 이 과정을 총 3-5회 반복합니다(첫 번째 세척 포함 4-6회 세척). 대부분의 응용의 경우, 각 5분씩 4-5회 세척이 충분합니다.
3
최종 1차 세척 확인:최종 세척 후, 과량의 TBST를 간단히 배수합니다. 멤브레인이 2차 항체 배양 준비가 되어 있어야 합니다. 세척 사이 또는 2차 항체 추가 전에 멤브레인이 마르지 않도록 하세요.

Tips:

각 세척에 항상 신선한 TBST를 사용하세요 - 세척 버퍼 재사용은 효과를 감소시킵니다
충분한 부피를 보장하세요 - 멤브레인이 자유롭게 떠다니고 컨테이너에 달라붙지 않아야 합니다
부드러운 교반을 유지하세요 - 너무 격렬한 흔들기는 멤브레인을 손상시킬 수 있습니다
불필요하게 세척 시간을 연장하지 마세요 - 세척당 5분이 표준입니다

2차 항체 배양 후:

1
초기 세척:2차 항체 용액에서 멤브레인을 제거합니다. 과량의 용액을 배수합니다. 신선한 TBST(20-50 mL)에 놓습니다. 부드러운 흔들기로 각 5분씩 3-5회 세척하며, 각 세척 사이에 TBST를 교체합니다. 이것은 결합되지 않은 2차 항체를 제거합니다.
2
높은 배경을 위한 연장 세척:배경이 높은 경우, 각 10분씩 5-7회 세척으로 증가시키세요. 또는 더 엄격한 세척을 위해 TBST에 0.1% SDS를 추가하세요(100 mL TBST에 100 μL 10% SDS 추가). SDS는 비특이적으로 결합된 항체를 제거하는 데 도움이 됩니다.
3
최종 헹굼 (선택사항):화학발광 검출의 경우, TBS(Tween-20 없음)로 한 번의 최종 빠른 헹굼(30초 ~ 1분)을 수행하세요. 이것은 일부 ECL 기질을 방해할 수 있는 잔류 Tween-20을 제거합니다. 검출로 진행하기 전에 과량의 TBS를 배수하세요.

Tips:

2차 항체 세척이 더 중요합니다 - 결합되지 않은 2차 항체는 높은 배경을 일으킵니다
세척 중 배경을 모니터링하세요 - 5회 세척 후에도 여전히 높으면 세척을 연장하세요
형광 검출의 경우, 최종 TBS 헹굼은 일반적으로 필요하지 않습니다
과도하게 세척하지 마세요 - 과도한 세척은 특이적 신호를 감소시킬 수 있습니다

세척 최적화:

배경이 높은 경우:

세척 횟수 증가: 3-5회 대신 5-7회 세척
세척 지속 시간 증가: 세척당 5분 대신 10분
세척 버퍼에 0.1% SDS 추가: 0.1% SDS가 포함된 TBST 준비(100 mL TBST당 100 μL 10% SDS 추가)
최종 세척에 TBS 사용: 마지막 2-3회 세척에 TBST를 TBS(Tween-20 없음)로 교체
세척 부피 증가: 세척당 20-50 mL 대신 50-100 mL 사용
항체 농도 확인: 높은 배경은 항체 농도가 너무 높을 수 있음을 나타낼 수 있습니다

세척 후 신호가 약해지는 경우:

세척 횟수 감소: 5회 대신 3회 세척 시도
세척 지속 시간 감소: 세척당 5분 대신 3분 시도
항체 결합 확인: 약한 신호는 1차 항체 결합이 나쁠 수 있음을 나타낼 수 있습니다 - 양성 대조군으로 확인하세요
항체가 세척되지 않는지 확인: 일부 항체는 더 약한 결합을 가집니다 - 세척 강도 감소
검출 시약 확인: ECL 기질 또는 형광 검출 시약이 신선하고 작동하는지 확인하세요

검출 방법

장비 및 감도 요구사항에 따라 검출 방법을 선택하세요. 각 방법은 특정한 장점과 프로토콜을 가집니다.

화학발광 검출 - 상세 프로토콜

가장 민감한 방법으로 널리 사용됩니다. ECL 기질 및 X선 필름 또는 이미징 시스템이 필요합니다. 우수한 감도와 동적 범위를 제공합니다.

1
ECL 기질 준비:제조업체의 지침에 따라 ECL 기질 성분을 혼합합니다. 대부분의 ECL 키트는 사용 직전에 1:1로 혼합되는 두 가지 성분(루미놀 및 과산화물)을 가집니다. 동일한 부피를 혼합하고 즉시 사용하세요.
2
멤브레인 배양:멤브레인을 단백질 면이 위로 오도록 깨끗한 표면에 놓습니다. 멤브레인에 ECL 기질을 피펫팅하여 완전한 커버리지를 보장합니다. 실온에서 1-5분간 배양합니다. 더 긴 배양(최대 5분)은 신호를 증가시킬 수 있지만 배경도 증가시킬 수 있습니다.
3
과량의 기질 제거:멤브레인을 기울여 과량의 기질을 배수합니다. 멤브레인이 마르지 않도록 하세요. 플라스틱 랩으로 감싸거나 이미징 카세트에 놓습니다. 멤브레인과 랩 사이에 공기 거품이 없도록 하세요.
4
이미지 캡처:X선 필름의 경우: 신호 강도에 따라 1초에서 10분까지 필름을 노출합니다. 짧은 노출(1-5초)로 시작하고 조정하세요. 제조업체의 지침에 따라 필름을 현상합니다. CCD 카메라의 경우: 이미징 시스템에 놓고 이미지를 캡처합니다. 포화를 피하기 위해 노출 시간을 조정하세요.
5
다중 노출:선형 범위 내에서 강한 밴드와 약한 밴드를 모두 캡처하기 위해 다른 시간에 여러 번 노출합니다. 각 이미지의 노출 시간을 문서화하세요.

형광 검출 - 상세 프로토콜

형광 표지 2차 항체를 사용하는 정량적 방법. 필름이 필요 없으며, 다른 색상으로 다중 검출을 허용합니다.

1
2차 항체 선택:형광 표지 2차 항체를 사용하세요. 일반적인 옵션: IRDye 680/800 (LI-COR), Alexa Fluor 488/555/647 또는 DyLight 결합체. 여러 단백질을 검출하는 경우 겹치지 않는 파장을 선택하세요.
2
배양:항체 배양 섹션에 설명된 대로 형광 2차 항체와 배양합니다. 광표백을 방지하기 위해 배양 중 및 배양 후 빛으로부터 보호하세요.
3
세척:설명된 대로 TBST로 철저히 세척합니다. 최종 세척은 배경 형광을 감소시키기 위해 TBS로 할 수 있습니다.
4
스캔:형광체에 적합한 레이저 파장으로 멤브레인을 스캔합니다. IRDye의 경우: 680 nm 및 800 nm 채널. Alexa Fluor의 경우: 적절한 여기 파장을 사용하세요. 최적의 신호를 위해 레이저 전력 및 스캔 해상도를 조정하세요.
5
이미지 분석:이미징 소프트웨어를 사용하여 밴드 강도를 정량화합니다. 대부분의 시스템은 내장 정량화 도구를 제공합니다. 모든 밴드가 선형 검출 범위 내에 있는지 확인하세요.

비색 검출 - 상세 프로토콜

색상 밴드를 생성하는 발색 기질을 사용하는 간단한 방법. 특수 장비가 필요 없지만 다른 방법보다 덜 민감합니다.

1
기질 준비:제조업체의 지침에 따라 발색 기질을 준비합니다. DAB (3,3'-다이아미노벤지딘)는 갈색 밴드를 생성합니다. BCIP/NBT는 보라색/파란색 밴드를 생성합니다. TMB는 파란색 밴드를 생성합니다.
2
멤브레인 배양:멤브레인을 기질 용액에 놓습니다. 부드러운 흔들기로 실온에서 배양합니다. 신호 강도에 따라 5-30분 내에 밴드가 나타납니다.
3
반응 정지:밴드가 원하는 강도에 도달하면 물 또는 정지 용액(제공된 경우)으로 세척하여 반응을 정지합니다. DAB의 경우 물로 정지합니다. BCIP/NBT의 경우 밴드가 보일 때 물로 정지합니다.
4
즉시 문서화:스캔하거나 촬영하여 결과를 즉시 문서화하세요. 색상은 시간이 지나면서 사라질 수 있으며, 특히 일부 기질의 경우 그렇습니다.

웨스턴 블롯 정량화

정확한 정량화는 적절한 정규화 및 분석 방법이 필요합니다. 이 섹션은 웨스턴 블롯 결과를 정량화하는 상세한 프로토콜을 제공합니다.

ImageJ 분석 (무료, 오픈 소스):

1
ImageJ에서 이미지를 엽니다(파일 > 열기). 필요하면 8비트 또는 16비트 그레이스케일로 변환합니다(이미지 > 유형 > 8비트).
2
Rectangle 도구를 사용하여 첫 번째 밴드 주위에 사각형을 그립니다. 분석 > 겔 > 첫 번째 레인 선택(또는 '1' 키 누름)으로 이동합니다.
3
사각형을 다음 밴드로 이동하고 두 번째 레인에 대해 '2' 키를 누릅니다. 레인의 모든 밴드에 대해 반복합니다.
4
첫 번째 레인의 모든 밴드를 선택한 후 '3' 키를 눌러 다음 레인으로 이동합니다. 선택 과정을 반복합니다.
5
모든 밴드가 선택되면 분석 > 겔 > 레인 플롯으로 이동합니다. 이것은 강도 프로필을 생성합니다.
6
Wand 도구를 사용하여 피크를 선택하고 곡선 아래 영역(적분 밀도)을 측정합니다.
7
각 밴드에 대한 값을 기록합니다. 위에 설명된 대로 비율을 계산하고 정규화하세요.

정량화 팁 및 모범 사례

모든 샘플이 선형 검출 범위 내에 있는지 확인하세요 - 포화된 밴드는 정확하게 정량화할 수 없습니다
화학발광을 사용할 때 모든 샘플에 대해 동일한 노출 시간을 사용하세요 - 다른 노출은 비교를 무효화합니다
여러 생물학적 반복(최소 n=3)을 포함하세요 - 기술적 반복만으로는 충분하지 않습니다
적절한 통계 분석을 사용하세요 - 확실하지 않으면 생물통계학자와 상담하세요
모든 분석 매개변수(노출 시간, 소프트웨어 설정, 정규화 방법)를 문서화하세요
로딩 대조군이 실험 조건에 적절한지 확인하세요
로딩 대조군의 대안 또는 보완으로 총 단백질 정규화 사용을 고려하세요
조건 간에 로딩 대조군이 변하면 배수 변화가 과소평가될 수 있음을 인식하세요
출판을 위해 보충 자료에 원본 이미지 및 정량화 데이터를 포함하세요

웨스턴 블롯 문제 해결 가이드

웨스턴 블롯 실험에서 일반적인 문제 및 해결책.

신호 없음 또는 약한 신호

1차 항체 농도가 너무 낮음:

항체 농도를 증가시키거나 배양 시간을 연장하세요

단백질이 멤브레인으로 전사되지 않음:

Ponceau S로 멤브레인을 염색하여 전사 효율을 확인하세요. 전사 조건을 최적화하세요.

항체가 표적에 특이적이지 않음:

양성 및 음성 대조군으로 항체 특이성을 확인하세요

검출 시약이 만료되었거나 부적절하게 저장됨:

신선한 검출 시약을 사용하고, 제조업체의 지침에 따라 저장하세요

높은 배경

불충분한 차단:

차단 시간을 2시간까지 증가시키거나 더 높은 농도(10% 우유)를 사용하세요

항체 농도가 너무 높음:

항체를 더 희석하고, 적정을 통해 최적화하세요

불충분한 세척:

세척 횟수와 지속 시간을 증가시키고, 세척 버퍼에 0.1% SDS를 추가하세요

멤브레인 오염:

깨끗한 핀셋을 사용하고, 맨손으로 멤브레인을 만지지 마세요

비특이적 밴드

항체 교차 반응성:

더 특이적인 항체 또는 사전 흡착된 2차 항체를 사용하세요

단백질 분해:

신선한 샘플을 사용하고, 프로테아제 억제제를 추가하세요

불완전한 변성:

샘플이 95°C에서 5분간 가열되었는지 확인하세요

Troubleshoot incomplete transfer, uneven transfer, and transfer optimization issues.

Antibody Problems

Fix weak signals, non-specific binding, and antibody optimization issues.

Blocking Problems

Resolve high background, weak signals, and blocking optimization issues.

Detection Problems

Troubleshoot weak signals, detection optimization, and detection method issues.

Sample Degradation

Prevent and fix protein degradation issues in sample preparation and storage.

Protein Not Transferring

Fix complete transfer failure and protein retention in gel issues.

Membrane Problems

Complete Optimization Guide →

Troubleshoot PVDF and nitrocellulose membrane issues, activation, and optimization.

불완전한 전사

큰 단백질(>100 kDa)이 전사되지 않음:

전사 시간을 2-3시간까지 연장하고, 메탄올 농도를 10%로 감소시키고, 전사 버퍼에 0.1% SDS를 추가하거나, 더 낮은 전압(70-80V)을 더 오래 사용하세요. 0.2 μm 기공 크기 멤브레인 사용을 고려하세요.

작은 단백질(<20 kDa)이 멤브레인을 통과함:

전사 시간을 30-45분으로 감소시키고, 메탄올을 25%로 증가시키거나, 0.45 μm 대신 0.2 μm 기공 크기 멤브레인을 사용하세요. Ponceau S 염색으로 확인하세요.

멤브레인 전체에 걸쳐 불균일한 전사:

겔과 멤브레인 사이의 좋은 접촉을 보장하고, 테스트 튜브로 굴려 모든 공기 거품을 제거하고, 전사 스택이 적절히 조립되었는지 확인하고, 전사 중 버퍼가 잘 교반되는지 확인하세요

Step-by-Step Problem-Solving Guides

프로토콜 최적화 전략

최상의 결과를 위해 웨스턴 블롯 프로토콜을 최적화하는 체계적인 접근. 한 번에 하나의 매개변수를 변경하고 모든 변경사항을 문서화하세요. 이 포괄적인 가이드는 신호 대 잡음비를 향상시키고, 재현성을 개선하며, 출판 품질의 결과를 달성하기 위한 증거 기반 전략을 제공합니다.

샘플 최적화 - 상세 가이드

최대 단백질 수율과 품질을 보장하기 위해 샘플 준비를 최적화하세요. 샘플 최적화는 성공적인 웨스턴 블롯의 기초입니다 - 나쁜 샘플 품질은 후속 단계로 보상할 수 없습니다.

용해 버퍼 선택:

RIPA 버퍼: 가장 일반적, 대부분의 단백질에 좋음, 완전한 용해를 위한 계면활성제(NP-40, deoxycholate, SDS) 포함. 세포질 및 핵 단백질에 가장 적합. 일부 막 단백질에는 너무 강할 수 있음.
NP-40 버퍼: 더 온화함, 막 단백질 및 단백질 복합체에 좋음, 덜 변성적. RIPA보다 단백질-단백질 상호작용을 더 잘 보존함.
Laemmli 버퍼: 직접 용해, 별도의 용해 단계 불필요. 가장 빠른 방법이지만 모든 단백질을 효율적으로 추출하지 못할 수 있음.
Urea/Thiourea 버퍼: 용해하기 어려운 단백질, 특히 막 단백질용. 신중한 pH 조정 필요.
단백질에 가장 적합한 것을 찾기 위해 다른 버퍼를 체계적으로 테스트하세요

대부분의 응용에 대해 RIPA로 시작하세요. 신호가 약하거나 단백질이 분해된 것으로 보이면 NP-40을 테스트하세요. 막 단백질의 경우 먼저 NP-40을 시도하세요. 핵 단백질의 경우 더 강한 조건 또는 순차적 추출이 필요할 수 있습니다. 인산화된 단백질의 경우 포스파타제 억제제가 포함되었는지 확인하세요.

단백질 농도:

일반적인 로딩: 대부분의 응용에 대해 웰당 20-50 μg 총 단백질
높게 발현된 단백질(예: 액틴, 튜불린)의 경우: 10-20 μg이면 종종 충분함
낮은 풍부도의 단백질(예: 전사 인자, 키나제)의 경우: 50-100 μg이 필요할 수 있음
매우 낮은 풍부도의 단백질의 경우: 최대 150 μg이지만 번짐 및 인공물을 모니터링하세요
너무 많은 단백질(>100 μg)은 번짐, 낮은 분해능을 일으키고 검출을 포화시킬 수 있음
너무 적은 단백질(<10 μg)은 검출되지 않을 수 있으며, 특히 낮은 풍부도 표적의 경우

기준선으로 30 μg으로 시작하세요. 신호가 약하면 50-75 μg으로 증가시키세요. 밴드가 번지거나 분해능이 나쁘면 20-25 μg으로 감소시키세요. 정량적 비교의 경우, 모든 샘플이 동일한 단백질 농도를 가지는지 확인하세요. 정확한 정량화를 위해 BCA 또는 Bradford 분석을 사용하세요 - 추정하지 마세요.

샘플 버퍼 비율:

표준: 샘플 3부에 4X 샘플 버퍼 1부(최종 1X 농도)
농축된 샘플(>10 mg/mL)의 경우: 과농축을 피하기 위해 버퍼를 추가하기 전에 샘플을 희석해야 할 수 있음
희석된 샘플(<1 mg/mL)의 경우: 버퍼를 추가하기 전에 농축하거나 2X 샘플 버퍼를 사용해야 할 수 있음
적절한 변성을 위해 최종 SDS 농도가 충분한지(0.1-0.2%) 확인하세요
최종 글리세롤 농도(5-10%)는 샘플이 웰로 가라앉는 데 도움이 됩니다

밴드가 선명하지 않거나 단백질이 응집된 것으로 보이면 샘플 버퍼 비율을 증가시키거나 적절한 가열을 보장하세요. 샘플이 너무 점성이 있으면 적절히 희석하세요. 가열 직전에 항상 신선한 환원제(2-ME 또는 DTT)를 추가하세요.

가열 조건:

표준: 95°C에서 5분 - 대부분의 단백질에 작동하며, 완전한 변성을 보장함
대안: 70°C에서 10분 - 더 온화함, 95°C에서 응집되는 온도 민감한 단백질용
일부 단백질은 고온에서 응집될 수 있음 - 최적을 찾기 위해 60°C, 70°C, 80°C, 95°C를 테스트하세요
막 단백질의 경우: 때로는 37°C에서 30분이 고온보다 더 잘 작동함
가열을 건너뛰지 마세요 - 불완전한 변성은 나쁜 이동과 인공물을 일으킵니다

응집을 시사하는 여러 밴드나 번짐을 보면 더 낮은 온도를 테스트하세요. 밴드가 선명하지 않거나 이동이 일관되지 않으면 가열이 완료되었는지 확인하세요(샘플이 실제로 온도에 있는지 확인). 히트 블록 또는 수조를 사용하세요 - 마이크로웨이브 가열은 일관되지 않습니다.

억제제 추가:

사용 직전에 항상 신선한 억제제를 추가하세요 - 시간이 지나면서 분해됩니다
프로테아제 억제제: PMSF (1 mM) 또는 상용 칵테일(제조업체의 지침을 따르세요)
포스파타제 억제제: NaF (10-50 mM), Na3VO4 (1-2 mM) 또는 상용 칵테일
인산화된 단백질의 경우: 포스파타제 억제제가 중요합니다 - 즉시 용해 버퍼에 추가하세요
억제제 원액을 적절히 저장하세요: PMSF는 이소프로판올에, Na3VO4는 물에, 칵테일은 권장대로

분해 산물(여러 낮은 분자량 밴드)을 보면 프로테아제 억제제 농도를 증가시키거나 다른 억제제를 시도하세요. 인산화 신호가 약하거나 일관되지 않으면 포스파타제 억제제가 신선하고 올바른 농도인지 확인하세요.

겔 최적화 - 상세 가이드

최상의 단백질 분리를 위해 겔 조건을 최적화하세요. 겔 최적화는 분해능에 직접 영향을 미치며, 이는 특정 단백질을 검출하고 비특이적 밴드와 구별하는 능력을 결정합니다.

적절한 겔 최적화는 다음을 보장합니다: (1) 분자량에 기반한 최적 단백질 분리, (2) 선명하고 잘 분해된 밴드, (3) 표적 단백질에 대한 적절한 이동 거리, (4) 최소 인공물 및 번짐

겔 백분율:

겔 백분율은 기공 크기를 결정하고 단백질 이동에 직접 영향을 미칩니다. 최적의 백분율은 단백질이 최상의 분해능을 위해 분리 겔의 중간 1/3로 이동할 수 있게 합니다.

10% 겔로 시작하세요(가장 다용도, 30-100 kDa 단백질에 작동). <20 kDa 단백질의 경우 더 나은 분리를 위해 15-20%로 증가시키세요. >100 kDa 단백질의 경우 이동을 허용하기 위해 6-8%로 감소시키세요. 다른 백분율을 체계적으로 테스트하세요: 8%, 10%, 12%, 15% 겔을 준비하고 동일한 샘플을 실행하여 분해능을 비교하세요.

<20 kDa 단백질: 15-20% 겔을 사용하세요. 더 높은 백분율은 더 작은 기공을 생성하여 작은 단백질에 대해 더 나은 분리를 제공합니다. 예: 히스톤, 작은 펩타이드, 분해 산물.:

<20 kDa 단백질: 15-20% 겔을 사용하세요. 더 높은 백분율은 더 작은 기공을 생성하여 작은 단백질에 대해 더 나은 분리를 제공합니다. 예: 히스톤, 작은 펩타이드, 분해 산물.

20-100 kDa 단백질: 10-12% 겔을 사용하세요. 이것은 가장 일반적인 범위입니다. 예: 대부분의 신호 전달 단백질, 전사 인자, 대사 효소.:

20-100 kDa 단백질: 10-12% 겔을 사용하세요. 이것은 가장 일반적인 범위입니다. 예: 대부분의 신호 전달 단백질, 전사 인자, 대사 효소.

>100 kDa 단백질: 6-8% 겔을 사용하세요. 더 낮은 백분율은 더 큰 기공을 생성하여 큰 단백질이 이동할 수 있게 합니다. 예: 수용체, 큰 전사 인자, 구조 단백질.:

>100 kDa 단백질: 6-8% 겔을 사용하세요. 더 낮은 백분율은 더 큰 기공을 생성하여 큰 단백질이 이동할 수 있게 합니다. 예: 수용체, 큰 전사 인자, 구조 단백질.

단백질 크기를 모르는 경우: 10%로 시작하거나, 성공 가능성을 높이기 위해 그라디언트 겔(4-20% 또는 8-16%)을 사용하세요.:

단백질 크기를 모르는 경우: 10%로 시작하거나, 성공 가능성을 높이기 위해 그라디언트 겔(4-20% 또는 8-16%)을 사용하세요.

8%, 10%, 12%, 15% 겔을 준비하세요. 각각에 동일한 샘플을 로드하세요. 비교: (1) 밴드 선명도, (2) 이동 거리(표적은 겔의 중간 1/3에 있어야 함), (3) 다른 밴드와의 분리, (4) 분자량 마커의 분해능. 표적에 대해 최상의 분해능을 제공하는 백분율을 선택하세요.

그라디언트 겔:

그라디언트 겔은 겔 전체에 걸쳐 가변 기공 크기를 제공하여 넓은 분자량 범위에 걸친 단백질에 대해 더 나은 분해능을 제공합니다.

같은 겔에서 다른 크기의 여러 단백질을 검출할 때단백질 크기를 모르거나 변할 수 있을 때(예: 스플라이스 변이체)새로운 표적 단백질을 최적화할 때많은 단백질이 있는 복잡한 샘플(예: 전체 세포 용해물)용

겔 두께:

겔 두께는 단백질 용량, 분해능 및 취급 특성에 영향을 미칩니다.

최적화를 위해 1.0 mm로 시작하세요. 분해능이 나쁘고 샘플이 제한적이면 0.75 mm를 시도하세요. 신호가 약하고 더 많이 로드할 수 있으면 1.5 mm를 시도하세요.

1.0 mm: 표준 두께, 좋은 분해능, 취급하기 쉬움, 가장 일반적으로 사용됨 (표준 단백질 용량(웰당 일반적으로 20-50 μg)) - 대부분의 응용에 권장, 특히 최적화 중
1.5 mm: 더 많은 단백질 용량, 필요시 더 많은 샘플을 로드할 수 있음 (더 높은 단백질 용량(필요시 최대 100 μg까지 로드 가능)) - 약간 낮은 분해능, 더 두꺼운 겔은 더 느리게 실행됨 - 높은 양의 단백질을 로드해야 할 때(낮은 풍부도 표적)
0.75 mm: 더 높은 분해능, 더 빠른 실행, 작은 단백질에 더 좋음 (더 낮은 단백질 용량(웰당 일반적으로 10-30 μg)) - 더 취약함, 취급하기 어려움, 신중한 로딩 필요 - 고해상도 응용, 작은 단백질 또는 샘플이 제한적일 때

실행 조건:

전압 및 실행 시간은 분리 품질, 밴드 선명도 및 잠재적 인공물에 영향을 미칩니다.

기준선으로 100V 일정 전압으로 시작하세요. 밴드가 흐릿하거나 '웃음'(곡선 이동)을 보이면 80V로 감소시키고 더 오래 실행하세요. 실행이 너무 느리고 밴드가 선명하면 120V로 증가시킬 수 있지만 온도를 면밀히 모니터링하세요. 큰 단백질(>100 kDa)의 경우 과열을 방지하고 전사를 개선하기 위해 항상 더 낮은 전압(60-80V)을 사용하세요.

겔 준비 품질:

겔 준비의 품질은 분해능과 재현성에 직접 영향을 미칩니다.

일반적인 겔 문제 및 해결책:

밴드가 흐릿하거나 번짐:

Causes: 겔 실행이 너무 빠름, 과부하, 불완전한 중합, 온도가 너무 높음

Solutions: 전압 감소, 단백질 로딩 감소, 완전한 중합 보장, 냉각 사용

밴드가 불균일하게 이동함(웃음 효과):

Causes: 겔이 수평이 아님, 버퍼 수준이 불균일함, 온도 구배, 겔 두께 변화

Solutions: 겔 장치를 수평으로 하고, 균일한 버퍼 수준을 보장하고, 일관된 온도를 유지하고, 겔 두께를 확인하세요

낮은 분해능:

Causes: 잘못된 겔 백분율, 불완전한 중합, 실행이 너무 빠름, 겔이 너무 오래됨

Solutions: 다른 겔 백분율을 테스트하고, 완전한 중합을 보장하고, 전압을 감소시키고, 신선한 겔을 사용하세요

전사 최적화 - 상세 가이드