Western Blot Hub

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적절한 샘플 준비는 성공적인 웨스턴 블롯에 중요합니다. 이 섹션은 단계별 지침과 함께 다양한 소스에서 샘플을 준비하는 상세한 방법을 다룹니다.

세포 용해물 준비

배양된 세포에서 단백질 용해물을 준비하는 상세한 프로토콜. 적절한 용해 조건은 단백질 무결성을 유지하고 분해를 방지하는 데 필수적입니다.

1
배지 medium을 제거하고 얼음처럼 차가운 PBS(인산 완충 식염수)로 세포를 2-3회 세척합니다. 용해 버퍼의 희석을 피하기 위해 모든 PBS가 완전히 제거되었는지 확인하세요. 부착 세포의 경우 접시에 PBS를 직접 추가합니다. 현탁 세포의 경우 500-1000 × g에서 5분간 원심분리하여 세포를 펠렛으로 만듭니다.
2
신선한 용해 버퍼를 준비하거나 -20°C에 저장된 분할 버퍼를 사용합니다. 사용 직전에 프로테아제 억제제(예: 최종 농도 1 mM의 PMSF 또는 상용 프로테아제 억제제 칵테일) 및 포스파타제 억제제(예: 10 mM NaF, 1 mM Na3VO4)를 추가합니다. 전체 과정 동안 버퍼를 얼음처럼 차갑게 유지하세요.
3
적절한 양의 용해 버퍼를 추가합니다(일반적으로 10^6 세포당 100-200 μL 또는 배양 접시 cm²당 100-150 μL). 부착 세포의 경우 세포 스크래퍼를 사용하여 용해 버퍼에서 직접 세포를 긁어냅니다. 현탁 세포의 경우 용해 버퍼에 펠렛을 재현탁합니다. 사전에 냉각된 원심분리 튜브로 옮깁니다.
4
얼음 위에서 20-30분간 배양하며 5-10분마다 가끔 부드럽게 보텍싱합니다. 용해하기 어려운 세포의 경우 배양 시간을 45분까지 연장하거나 초음파 처리를 수행할 수 있습니다(얼음 위에서 각각 10초씩 3-5회 펄스).
5
4°C에서 12,000-14,000 × g로 15분간 원심분리합니다. 이것은 세포 파편, 핵 및 불용성 물질을 제거합니다. 일부 응용의 경우 더 높은 속도(20,000 × g)에서 원심분리하거나 순차적 원심분리를 수행해야 할 수 있습니다.
6
펠렛을 방해하지 않고 조심스럽게 상층액을 수집합니다. 새로운 사전 냉각된 튜브로 옮깁니다. 전기영동을 방해할 수 있는 불용성 응집체를 포함할 수 있으므로 펠렛 물질을 수집하지 마세요.
7
BCA, Bradford 또는 Lowry 분석을 사용하여 단백질 농도를 결정합니다. 항상 BSA 표준을 사용하여 표준 곡선을 준비하세요. 필요하면 샘플을 희석하여 분석의 선형 범위 내에 있도록 합니다. 세포 용해물의 일반적인 농도 범위는 1-10 mg/mL입니다.

Tips:

단백질 분해를 방지하기 위해 빠르게 작업하고 모든 것을 얼음 위에 보관하세요
시간이 지나면서 분해되므로 신선한 프로테아제 억제제를 사용하세요
인산화된 단백질의 경우 포스파타제 억제제가 필수적입니다
거품과 단백질 변성을 일으킬 수 있는 과도한 보텍싱을 피하세요
즉시 사용하지 않으면 -80°C에 용해물을 저장하세요

조직 샘플 준비

조직 샘플에서 단백질 추출물을 준비하는 프로토콜. 조직 균질화는 세포 용해보다 더 강력한 방법이 필요합니다.

1
신선한 조직을 수집하고 즉시 얼음 위에 놓거나 액체 질소로 급속 동결합니다. 동결된 조직의 경우 처리할 때까지 동결 상태를 유지하세요. 차가운 표면에서 메스 또는 면도날을 사용하여 조직을 작은 조각(2-3 mm³)으로 자릅니다.
2
얼음처럼 차가운 용해 버퍼에서 조직을 균질화합니다(일반적으로 조직 무게당 버퍼 10-20 부피, 예: 1-2 mL 버퍼에 100 mg 조직). 기계적 균질화기, 막자사발 또는 비드 비팅 시스템을 사용하세요. 단단한 조직의 경우 냉각 간격을 두고 여러 번 짧게 버스트(각각 10-15초)로 균질화를 수행하세요.
3
얼음 위에서 30분간 가끔 보텍싱하면서 균질화물을 배양합니다. 섬유성 조직의 경우 배양 시간을 45-60분까지 연장하세요. 일부 조직은 짧은 초음파 처리(얼음 위에서 각각 5초씩 3-5회 펄스)로 이점을 얻을 수 있습니다.
4
4°C에서 12,000-14,000 × g로 20분간 원심분리합니다. 높은 지질 함량을 가진 조직의 경우 더 높은 속도에서 원심분리하거나 추가 원심분리 단계를 수행해야 할 수 있습니다.
5
상층액에 보이는 파편이 포함되어 있거나 탁한 경우 0.45 μm 주사기 필터를 통해 여과하거나 다시 원심분리하세요. 일부 프로토콜은 거즈 또는 미세 메쉬를 통해 여과하는 것을 권장합니다.
6
단백질 농도를 결정합니다. 조직 추출물은 일반적으로 세포 용해물보다 높은 단백질 농도(5-20 mg/mL)를 가집니다. 정량 분석에 필요에 따라 희석하세요.

Tips:

단백질 분해를 방지하기 위해 처리할 때까지 조직을 동결 상태로 유지하세요
조직 유형에 적합한 균질화 방법을 사용하세요
일부 조직은 지질 또는 결합 조직을 제거하기 위한 추가 단계가 필요할 수 있습니다
동결-해동 주기를 피하기 위해 분할하여 -80°C에 추출물을 저장하세요

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단백질 정량화

정확한 단백질 정량화는 동일한 양의 단백질을 로드하는 데 필수적입니다. 제조업체의 지침에 따라 BCA, Bradford 또는 Lowry 분석을 사용하세요. 정확한 정량화를 위해 항상 표준 곡선을 준비하세요.

SDS-PAGE 전기영동

SDS-PAGE는 분자량에 따라 단백질을 분리합니다. 적절한 겔 준비 및 실행 조건은 분해능에 중요합니다. 이 섹션은 SDS-PAGE 겔을 준비하고 실행하는 상세한 단계별 지침을 제공합니다.

필요한 재료:

View Running Conditions Guide →

30% 아크릴아미드/Bis 용액 (29:1 또는 37.5:1 비율)
1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 (분리 겔용)
0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 (적층 겔용)
10% SDS (도데실 황산나트륨)
10% APS (과황산암모늄) - 신선하게 준비
TEMED (N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌다이아민)
탈이온수
겔 주조 시스템 (유리판, 스페이서, 빗)
이소프로판올 또는 물로 포화된 부탄올 (오버레이용)

분리 겔 준비 (10% 예시):

1
부피 계산:10% 분리 겔(총 10 mL)의 경우: 3.3 mL 30% 아크릴아미드, 2.5 mL 1.5 M Tris-HCl pH 8.8, 0.1 mL 10% SDS, 4.05 mL 탈이온수를 혼합합니다. 진공 하에서 10-15분간 탈기하여 용존 산소를 제거합니다.
2
중합제 추가:50 μL 10% APS와 10 μL TEMED를 추가합니다. 부드럽게 회전시켜 혼합합니다(거품이 생기므로 보텍싱하지 마세요). 즉시 겔 카세트에 약 1 cm 아래(빗이 위치할 곳)까지 부어 넣습니다.
3
오버레이:산소 접촉을 방지하고 평평한 겔 표면을 만들기 위해 이소프로판올 또는 물로 포화된 부탄올을 조심스럽게 오버레이합니다. 실온에서 30-45분간 중합시킵니다. 중합이 완료되면 명확한 계면이 보입니다.
4
오버레이 제거:오버레이를 버리고 탈이온수로 겔 상단을 세척합니다. 필터 종이로 상단 표면을 말리되, 겔을 만지지 않도록 주의하세요.

겔 백분율 가이드라인:

6-8%: >100 kDa 단백질용 (큰 단백질)
10%: 30-100 kDa 단백질용 (가장 일반적, 다용도)
12%: 15-60 kDa 단백질용
15%: 10-40 kDa 단백질용
18-20%: <20 kDa 단백질용 (작은 단백질)

적층 겔 준비 (5%):

1
적층 겔 용액 준비:5% 적층 겔(총 4 mL)의 경우: 0.67 mL 30% 아크릴아미드, 1.0 mL 0.5 M Tris-HCl pH 6.8, 0.04 mL 10% SDS, 2.25 mL 탈이온수를 혼합합니다. 시간이 허락하면 탈기하세요.
2
중합제 추가:25 μL 10% APS와 5 μL TEMED를 추가합니다. 부드럽게 혼합하고 즉시 분리 겔 위에 부어 넣습니다.
3
빗 삽입:거품을 피하기 위해 빗을 각도로 빠르게 삽입한 다음 곧게 만듭니다. 20-30분간 중합시킵니다. 빗 이빨에 명확한 선이 보이면 겔이 준비된 것입니다.
4
빗 제거:조심스럽게 빗을 제거하고 실행 버퍼 또는 탈이온수로 웰을 세척하여 중합되지 않은 아크릴아미드를 제거합니다. 이제 겔이 샘플 로딩 준비가 되었습니다.

샘플 로딩:

1
웰당 20-50 μg 단백질로 Laemmli 샘플 버퍼(최종 농도 1X)에 샘플을 준비합니다. 높게 발현된 단백질의 경우 10-20 μg를 사용하세요. 낮은 풍부도의 단백질의 경우 50-100 μg가 필요할 수 있습니다.
2
최소한 하나의 웰에 분자량 마커를 포함하세요. 사전 염색된 마커를 사용하면 전기영동 중 진행 상황을 모니터링할 수 있습니다.
3
피펫을 사용하여 거품을 피하면서 조심스럽게 샘플을 로드합니다. 샘플이 인접한 웰로 넘치지 않도록 천천히 로드하세요.
4
균일한 전류 분배를 보장하기 위해 빈 웰을 1X 샘플 버퍼로 채웁니다.

더 나은 분해능을 위한 팁

겔 중합을 위해 신선한 APS와 TEMED를 사용하세요 - 오래된 시약은 제대로 작동하지 않을 수 있습니다
겔 구조를 방해할 수 있는 거품을 방지하기 위해 APS를 추가하기 전에 겔 용액을 탈기하세요
사용하기 전에 겔이 완전히 중합되도록 하세요 - 불완전한 중합은 분해능 저하를 일으킵니다
단백질 크기에 적합한 겔 백분율을 사용하세요 - 잘못된 백분율은 분리 저하를 초래합니다
전기영동 중 일정한 온도를 유지하세요 - 온도 변동은 이동에 영향을 줍니다
버퍼 수준이 충분한지 확인하세요 - 낮은 버퍼는 불균일한 실행을 일으킵니다
신선한 실행 버퍼를 사용하세요 - 오래된 버퍼는 잘못된 pH 또는 전도도를 가질 수 있습니다
샘플 과부하를 피하세요 - 너무 많은 단백질은 밴드 번짐을 일으킵니다
가능하면 동일한 부피를 로드하세요 - 다른 부피는 레인 왜곡을 일으킬 수 있습니다

단백질 전사 방법

겔에서 멤브레인으로 단백질을 전사하는 것은 검출 감도를 결정하는 중요한 단계입니다. 이 섹션은 다양한 전사 방법에 대한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

PVDF 멤브레인 (권장):

1
멤브레인을 크기에 맞게 자릅니다 (겔보다 약간 크게)
2
100% 메탄올에 30초간 담가 멤브레인을 활성화합니다
3
전사 버퍼로 옮기고 5분간 평형화합니다
4
PVDF 멤브레인은 니트로셀룰로스보다 더 나은 단백질 결합 능력과 내구성을 가집니다

습식 전사 - 상세 프로토콜

가장 일반적으로 사용되는 방법으로, 모든 크기의 단백질에 대해 우수한 전사 효율을 제공합니다. 큰 단백질(>100 kDa)에 가장 적합합니다.

필요한 재료:

전사 버퍼 (PVDF용 25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% methanol)
PVDF 또는 니트로셀룰로스 멤브레인
여과지 (Whatman 3MM 또는 동등품)
전사 스펀지 또는 패드
전사 카세트
냉각 시스템이 있는 전사 탱크
얼음 또는 냉각 팩

1
겔 평형화:전기영동 후, 조심스럽게 플레이트에서 겔을 제거합니다. 전사 버퍼에서 겔을 15-30분간 평형화합니다. 이것은 과량의 SDS를 제거하고 전사 효율을 개선합니다. 평형화 중 부드럽게 흔들어주세요.
2
멤브레인 준비:PVDF의 경우: 크기에 맞게 자르고, 100% 메탄올에 30초간 담가 활성화한 다음, 전사 버퍼에서 5분간 평형화합니다. 니트로셀룰로스의 경우: 크기에 맞게 자르고 전사 버퍼에 직접 5분간 적십니다.
3
전사 스택 조립:전사 버퍼로 채워진 트레이에서 전사 스택을 조립합니다. 음극(검은색, 음극)에서 양극(빨간색, 양극)으로: (1) 스펀지, (2) 여과지 3장, (3) 겔(면이 아래로), (4) 멤브레인(겔 위에), (5) 여과지 3장, (6) 스펀지. 테스트 튜브로 굴리거나 롤러를 사용하여 모든 공기 거품을 제거하세요. 공기 거품은 해당 위치에서 단백질 전사를 방지합니다.
4
전사 조건:차가운 전사 버퍼로 채워진 전사 탱크에 카세트를 놓습니다. 버퍼가 카세트를 덮는지 확인하세요. 표준 전사의 경우: 4°C에서 100V로 1시간(얼음 또는 냉각 시스템 사용). 큰 단백질의 경우: 70-80V로 2-3시간. 밤새 전사의 경우: 4°C에서 30V로 밤새. 전사 중 버퍼가 차갑고 잘 교반되는지 확인하세요.
5
전사 검증:전사 후, Ponceau S(5% 아세트산에 0.1%)로 멤브레인을 2-5분간 염색하여 효율을 검증합니다. 물로 세척하여 단백질 밴드를 시각화합니다. 이것은 차단으로 진행하기 전에 성공적인 전사를 확인합니다. Ponceau S는 차단 전에 TBST로 세척할 수 있습니다.

반건식 전사 - 상세 프로토콜

최소한의 버퍼를 사용하는 더 빠른 방법. 작은 단백질부터 중간 크기 단백질(<100 kDa)에 적합합니다. 큰 단백질에는 덜 효율적입니다.

1
버퍼 준비:양극 버퍼 준비: 0.3 M Tris, 20% methanol, pH 10.4. 음극 버퍼 준비: 25 mM Tris, 40 mM glycine, 10% methanol, 0.01% SDS, pH 9.4. 각 버퍼에 여과지 3장을 담급니다.
2
양극에서 스택 조립:양극 플레이트에서: 양극 버퍼에 담근 여과지 3장을 놓습니다. 활성화된 PVDF 멤브레인을 위에 놓습니다(또는 적신 니트로셀룰로스). 굴려서 공기 거품을 제거하세요.
3
겔 배치:평형화된 겔을 조심스럽게 멤브레인 위에 놓습니다. 좋은 접촉을 보장하고 굴려서 모든 공기 거품을 제거하세요.
4
스택 완성:음극 버퍼에 담근 여과지 3장을 겔 위에 놓습니다. 공기 거품을 제거하세요. 전사 장치를 닫습니다.
5
전사:일정한 전류 적용: 겔 면적 cm²당 0.8-1.2 mA. 표준 미니 겔(8 x 10 cm)의 경우 15V로 30-60분 사용합니다. 온도를 모니터링하세요 - 반건식 전사는 과열될 수 있습니다. 온도가 30°C를 초과하면 냉각을 사용하세요.

차단 및 항체 배양

적절한 차단 및 항체 조건은 낮은 배경으로 특이적 검출에 필수적입니다. 이 섹션은 각 단계에 대한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

차단 - 상세 프로토콜

차단은 항체의 멤브레인에 대한 비특이적 결합을 방지하여 배경 신호를 감소시킵니다.

Blocking Solutions:

TBST에 5% 무지방 우유 (표준):

100 mL TBST에 5 g 무지방 분유를 용해합니다. 완전히 용해될 때까지 잘 혼합합니다. 용해되지 않은 입자를 제거하기 위해 거즈를 통해 여과해야 할 수 있습니다. 신선하게 준비하거나 4°C에 최대 1주일 보관합니다. 사용 전에 잘 흔들어주세요.

Applications: 대부분의 일반적인 응용, 비용 효율적, 대부분의 항체에 잘 작동

Limitations: 인산 특이적 항체를 방해할 수 있는 카제인을 포함하며, 일부 항체에 높은 배경을 일으킬 수 있습니다

TBST에 3-5% BSA (인산화된 단백질용):

100 mL TBST에 3-5 g BSA(소 혈청 알부민, Fraction V)를 용해합니다. 거품을 피하기 위해 부드럽게 혼합합니다. 필요하면 0.45 μm 필터를 통해 여과합니다. 4°C에 보관합니다. 1주일 이내에 사용하세요.

Applications: 인산화된 단백질, 우유가 높은 배경을 일으킬 때, 일부 민감한 항체

Advantages: 카제인 간섭 없음, 인산 항체에 낮은 배경, 더 일관적

1
차단 용액 준비:차단 용액을 신선하게 준비하거나 저장된 용액을 사용하세요(유통기한 확인). 5% 우유의 경우: 100 mL TBST에 5 g 무지방 분유를 용해합니다. 완전히 용해될 때까지(5-10분) 회전시키거나 부드럽게 뒤집어 잘 혼합합니다. 입자가 남아 있으면 거즈 또는 0.45 μm 필터를 통해 여과하세요. BSA의 경우: 100 mL TBST에 3-5 g BSA를 용해하고, 거품을 피하기 위해 부드럽게 혼합합니다. 즉시 사용하지 않으면 4°C에 보관하세요.
2
Ponceau S 염색 제거 (선택사항):Ponceau S 염색으로 전사를 검증한 경우, 염색을 제거하기 위해 TBST로 멤브레인을 간단히 세척합니다(빠른 세척 2-3회, 각 30초). 이 단계는 선택사항입니다 - Ponceau S는 후속 세척 중 제거되므로 그대로 둘 수 있습니다. 과량의 TBST를 배수하되 멤브레인이 마르지 않도록 하세요.
3
멤브레인을 차단 용액으로 옮기기:멤브레인을 단백질 면이 위로 오도록 차단 용액에 놓습니다. 멤브레인을 완전히 덮을 수 있는 충분한 부피를 사용하세요: 미니 겔(8 x 10 cm)은 10-20 mL가 필요하며, 더 큰 멤브레인은 30-50 mL가 필요할 수 있습니다. 멤브레인이 자유롭게 떠다니고 완전히 잠기도록 하세요. 부드럽게 두드리거나 핀셋을 사용하여 공기 거품을 제거하세요.
4
부드러운 교반으로 배양:컨테이너를 부드러운 속도(20-30 rpm)로 설정된 로커 또는 셰이커에 놓습니다. 실온(20-25°C)에서 1시간 동안 배양합니다. 높은 배경 문제의 경우 2시간까지 연장하거나 더 높은 농도(10% 우유)를 사용하세요. 또는 편리한 경우 4°C에서 밤새(12-16시간) 차단할 수 있습니다 - 이것은 일부 응용에 대해 차단 효율을 개선할 수 있습니다.
5
1차 항체로 진행:차단 후 멤브레인을 세척하지 마세요. 가장자리를 종이 타월에 닿게 하여 과량의 차단 용액을 배수하되, 멤브레인이 마르지 않도록 하세요. 1차 항체를 희석하는 데 사용한 것과 동일한 유형의 차단 용액(우유 또는 BSA)을 사용하여 즉시 1차 항체 배양으로 진행하세요.

Tips:

멤브레인이 차단 용액에 완전히 잠기도록 하세요 - 불충분한 커버리지는 높은 배경을 일으킵니다
부드러운 흔들기 또는 로킹(20-30 rpm)을 사용하세요 - 너무 격렬한 흔들기는 멤브레인을 손상시키거나 불균일한 차단을 일으킬 수 있습니다
편리한 경우 4°C에서 밤새 차단할 수 있습니다 - 이것은 차단 효율을 개선할 수 있습니다
인산화된 단백질의 경우 항상 우유가 아닌 BSA를 사용하세요 - 우유는 인산 특이적 항체를 방해하는 카제인을 포함합니다
가능하면 신선한 차단 용액을 준비하세요 - 저장된 용액은 효과를 잃을 수 있습니다
충분한 부피를 사용하세요 - 멤브레인이 자유롭게 떠다니고 컨테이너 벽에 달라붙지 않아야 합니다
차단 용액을 재사용하지 마세요 - 전사된 단백질이나 오염물질을 포함할 수 있습니다

1차 항체 배양 - 상세 프로토콜

1차 항체는 표적 단백질에 특이적으로 결합합니다. 적절한 희석 및 배양 조건이 중요합니다.

항체 희석:

단클론 항체: 차단 용액에서 일반적으로 1:1000 ~ 1:5000
다클론 항체: 차단 용액에서 일반적으로 1:500 ~ 1:2000
제조업체의 권장 희석으로 시작한 다음, 적정을 통해 최적화하세요
차단 용액(차단에 사용한 것과 동일한 용액)에서 항체를 희석하세요

Optimization: 신호가 약한 경우: 농도를 증가시키거나 배양을 연장하세요. 배경이 높은 경우: 농도를 감소시키거나 차단 시간을 증가시키세요.

배양 조건:

4°C에서 밤새 (권장)

최상의 신호 대 잡음비, 가장 민감한 검출. 부드러운 흔들기 또는 로킹으로 냉실 또는 냉장고에서 배양합니다.

Duration: 12-16시간

Advantages: 더 높은 감도, 더 나은 신호 대 잡음비, 편리한 타이밍

실온

더 빠른 방법, 밤새가 불가능할 때 적합합니다.

Duration: 부드러운 흔들기로 1-2시간

Advantages: 더 빠름, 당일 결과에 편리

Limitations: 약간 높은 배경을 가질 수 있으며, 밤새보다 덜 민감함

Volume: 멤브레인을 덮을 수 있는 충분한 부피를 사용하세요(미니 겔의 경우 일반적으로 5-10 mL). 보존제(0.02% 아지드나트륨)와 함께 4°C에서 적절히 저장하면 항체 용액을 2-3회 재사용할 수 있습니다.

1
항체 희석 계산 및 준비:멤브레인 크기에 따라 필요한 부피를 결정합니다: 미니 겔(8 x 10 cm)은 5-10 mL가 필요하며, 더 큰 멤브레인은 15-20 mL가 필요합니다. 필요한 항체 부피를 계산하세요. 예: 5 mL에서 1:1000 희석의 경우, 5 mL 차단 용액에 5 μL 1차 항체 원액을 추가합니다. 정확한 부피를 위해 마이크로피펫을 사용하세요. 위아래로 피펫팅하거나 컨테이너를 5-10회 뒤집어 부드럽게 혼합하세요. 거품이나 변성을 일으킬 수 있으므로 보텍싱하지 마세요.
2
멤브레인을 항체 용액으로 옮기기:차단 후, 과량의 차단 용액을 배수하세요(멤브레인이 마르지 않도록). 멤브레인을 단백질 면이 위로 오도록 1차 항체 용액에 놓습니다. 멤브레인이 완전히 덮이고 잠기도록 하세요. 작은 멤브레인의 경우 밀봉 가능한 백(밀봉 전 공기 거품 제거) 또는 작은 컨테이너를 사용하세요. 더 큰 멤브레인의 경우 완전히 덮을 수 있는 충분한 용액이 있는 트레이 또는 컨테이너를 사용하세요. 항체 이름, 희석 및 날짜로 컨테이너에 라벨을 붙이세요.
3
선택한 온도에서 배양:밤새 배양(권장)의 경우: 부드러운 흔들기 또는 로킹(20-30 rpm)으로 냉실 또는 냉장고(4°C)에 12-16시간 동안 놓습니다. 증발을 방지하기 위해 컨테이너가 밀봉되었는지 확인하세요. 실온 배양의 경우: 부드러운 흔들기로 실온(20-25°C)에서 로커에 1-2시간 동안 놓습니다. 온도를 모니터링하세요 - 과열을 피하세요. 밤새 배양은 일반적으로 더 나은 신호 대 잡음비를 제공합니다.
4
항체 용액 저장 (선택사항):배양 후, 1차 항체 용액을 재사용을 위해 저장할 수 있습니다. 박테리아 성장을 방지하기 위해 0.02% 아지드나트륨을 추가합니다(5 mL 용액당 10% 아지드나트륨 10 μL 추가). 밀봉된 컨테이너에 4°C에 보관합니다. 항체 이름, 희석, 날짜 및 사용 횟수로 라벨을 붙이세요. 대부분의 항체는 2-3회 재사용할 수 있지만, 사용할 때마다 신호가 감소할 수 있습니다. 오염이 의심되면 폐기하세요.
5
멤브레인 제거 및 세척으로 진행:깨끗한 핀셋을 사용하여 항체 용액에서 멤브레인을 조심스럽게 제거합니다. 가장자리를 종이 타월에 닿게 하여 과량의 용액을 배수합니다. 멤브레인이 마르지 않도록 하세요. 즉시 세척 단계로 진행하세요. 이 시점 이전에 멤브레인을 세척하지 마세요 - 1차 항체 배양 전 세척은 필요하지 않으며 신호를 감소시킬 수 있습니다.

Tips:

항상 차단에 사용한 것과 동일한 차단 용액(우유 또는 BSA)에서 1차 항체를 희석하세요
충분한 부피를 사용하세요 - 불충분한 부피는 불균일한 결합과 높은 배경을 일으킵니다
최상의 신호 대 잡음비를 위해 4°C에서 밤새 배양을 권장합니다
빛에 민감한 항체를 사용하는 경우 빛으로부터 보호하세요
모든 컨테이너에 항체 정보를 명확하게 라벨하세요
과정 중 어느 시점에서도 멤브레인이 마르지 않도록 하세요
아지드나트륨과 함께 적절히 저장하면 1차 항체 용액을 2-3회 재사용할 수 있습니다

2차 항체 배양 - 상세 프로토콜

2차 항체는 검출 분자(HRP, 형광 염료)에 결합되어 있으며 1차 항체에 결합합니다.

2차 항체는 1차 항체를 인식하고 결합하여 결합된 효소(HRP) 또는 형광 태그를 통해 검출을 가능하게 합니다. 적절한 선택, 희석 및 배양 조건은 최적의 신호 대 잡음비에 중요합니다. 항상 종 특이적 2차 항체(토끼 1차 항체용 항토끼, 마우스 1차 항체용 항마우스)를 사용하고 각 실험에 신선한 용액을 준비하세요.

2차 항체 선택:

1차 항체의 종에 특이적이어야 합니다(예: 토끼 1차 항체용 항토끼, 마우스 1차 항체용 항마우스)
교차 반응성을 최소화하기 위해 고도로 교차 흡착된 2차 항체를 사용하세요
적절한 결합체를 선택하세요: 화학발광용 HRP, 형광용 형광 염료(IRDye, Alexa Fluor)
다중 검출의 경우, 다른 발광 파장을 가진 2차 항체를 사용하세요

희석 가이드라인:

HRP-conjugated: HRP 결합: 차단 용액에서 1:5000 ~ 1:10000

Fluorescent: 형광 표지: 제조업체의 권장사항을 따르세요, 일반적으로 1:5000 ~ 1:15000

Optimization: 제조업체의 권장사항으로 시작한 다음 최적화하세요. 농도가 너무 높으면 높은 배경을 일으킵니다.

계산 예시: 1:5000 희석의 경우, 5 mL 차단 용액에 1 μL 2차 항체를 추가합니다. 1:10000의 경우, 5 mL에 0.5 μL를 추가합니다. 정확한 부피를 위해 마이크로피펫을 사용하세요. 뒤집기 또는 피펫팅으로 부드럽게 혼합하세요 - 거품을 일으킬 수 있으므로 보텍싱을 피하세요.

차단 용액(차단 단계에 사용한 것과 동일)에서 희석을 준비하세요. 멤브레인 크기에 따라 필요한 부피를 계산하세요: 미니 겔(8 x 10 cm)은 5-10 mL가 필요하며, 더 큰 멤브레인은 15-20 mL가 필요할 수 있습니다. 항상 신선하게 준비하세요 - 2차 항체 용액은 분해되고 후속 사용에서 높은 배경을 일으키므로 재사용하지 마세요.

1
2차 항체 용액 준비:필요한 부피를 계산합니다(미니 겔의 경우 5-10 mL). 깨끗한 컨테이너에 적절한 부피의 차단 용액을 추가합니다. 마이크로피펫을 사용하여 계산된 부피의 2차 항체 원액을 추가합니다. 5 mL에서 1:5000 희석의 경우: 1 μL 항체를 추가합니다. 위아래로 피펫팅하거나 컨테이너를 5-10회 뒤집어 부드럽게 혼합하세요. 보텍싱하지 마세요. 항체 이름, 희석 및 날짜로 컨테이너에 라벨을 붙이세요.
2
멤브레인을 항체 용액으로 옮기기:1차 항체 세척 후, 멤브레인에서 과량의 TBST를 간단히 배수하세요(마르지 않도록). 멤브레인을 단백질 면이 위로 오도록 2차 항체 용액에 놓습니다. 멤브레인이 완전히 잠기도록 하세요. 작은 멤브레인의 경우 밀봉 가능한 백 또는 컨테이너를 사용하세요. 더 큰 멤브레인의 경우 완전히 덮을 수 있는 충분한 용액이 있는 트레이 또는 컨테이너를 사용하세요. 부드럽게 두드리거나 핀셋을 사용하여 공기 거품을 제거하세요.
3
부드러운 교반으로 배양:부드러운 속도(20-30 rpm)로 설정된 로커 또는 셰이커에 컨테이너를 놓습니다. 실온(20-25°C)에서 1시간 동안 배양합니다. 형광 항체를 사용하는 경우, 컨테이너를 알루미늄 호일로 감싸거나 어두운 상자에 놓아 빛으로부터 보호하세요. 온도를 모니터링하세요 - 배경을 증가시킬 수 있는 과열을 피하세요. 신호를 개선하지 않고 배경을 증가시키므로 배양을 1.5시간을 초과하지 마세요.
4
멤브레인 제거 및 세척으로 진행:배양 후, 깨끗한 핀셋을 사용하여 항체 용액에서 멤브레인을 조심스럽게 제거합니다. 가장자리를 종이 타월에 닿게 하여 과량의 용액을 배수합니다. 멤브레인이 마르지 않도록 하세요. 즉시 세척 단계로 진행하세요. 2차 항체 용액을 폐기하세요 - 분해되고 후속 사용에서 높은 배경을 일으키므로 재사용하지 마세요.

Tips:

항상 2차 항체를 신선하게 준비하세요 - 용액을 재사용하지 마세요
배양 중 및 배양 후 형광 항체를 빛으로부터 보호하세요
교차 반응성을 피하기 위해 종 특이적 2차 항체를 사용하세요
실온에서 배양하세요 - 4°C 배양은 필요하지 않으며 신호를 감소시킬 수 있습니다
완전한 커버리지를 보장하세요 - 불충분한 용액은 불균일한 염색을 일으킵니다
불필요하게 배양 시간을 연장하지 마세요 - 더 긴 배양은 신호를 개선하지 않고 배경을 증가시킵니다
부드러운 교반을 사용하세요 - 너무 격렬한 흔들기는 멤브레인을 손상시키거나 불균일한 결합을 일으킬 수 있습니다

세척 - 상세 프로토콜

철저한 세척은 결합되지 않은 항체를 제거하고 배경 신호를 감소시킵니다.

적절한 세척은 결합되지 않은 1차 및 2차 항체를 제거하는 데 중요하며, 이는 배경 신호를 크게 감소시키고 신호 대 잡음비를 개선합니다. 세척은 철저해야 하지만 과도하지 않아야 하며, 과도한 세척은 특이적 신호를 감소시킬 수 있습니다. 각 세척에 신선한 TBST를 사용하고 멤브레인을 완전히 덮을 수 있는 충분한 부피를 보장하세요.

필요한 재료:

TBST (0.1% Tween-20이 포함된 Tris 완충 식염수)
TBS (Tween-20이 없는 Tris 완충 식염수) - 최종 세척용 선택사항
세척 컨테이너 또는 트레이
로킹 플랫폼 또는 셰이커
각 세척에 신선한 TBST (미니 겔의 경우 일반적으로 세척당 20-50 mL)

1차 항체 배양 후:

1
첫 번째 세척:깨끗한 핀셋을 사용하여 1차 항체 용액에서 멤브레인을 제거합니다. 가장자리를 종이 타월에 닿게 하여 과량의 항체 용액을 배수합니다. 즉시 멤브레인을 신선한 TBST(미니 겔의 경우 20-50 mL)에 놓습니다. 멤브레인이 완전히 잠기도록 하세요. 실온에서 부드러운 속도(20-30 rpm)로 로커에 5분간 놓습니다.
2
후속 세척:사용한 TBST를 완전히 버립니다. 신선한 TBST(20-50 mL)를 추가합니다. 부드러운 흔들기로 5분간 계속 세척합니다. 이 과정을 총 3-5회 반복합니다(첫 번째 세척 포함 4-6회 세척). 대부분의 응용의 경우, 각 5분씩 4-5회 세척이 충분합니다.
3
최종 1차 세척 확인:최종 세척 후, 과량의 TBST를 간단히 배수합니다. 멤브레인이 2차 항체 배양 준비가 되어 있어야 합니다. 세척 사이 또는 2차 항체 추가 전에 멤브레인이 마르지 않도록 하세요.

Tips:

각 세척에 항상 신선한 TBST를 사용하세요 - 세척 버퍼 재사용은 효과를 감소시킵니다
충분한 부피를 보장하세요 - 멤브레인이 자유롭게 떠다니고 컨테이너에 달라붙지 않아야 합니다
부드러운 교반을 유지하세요 - 너무 격렬한 흔들기는 멤브레인을 손상시킬 수 있습니다
불필요하게 세척 시간을 연장하지 마세요 - 세척당 5분이 표준입니다

2차 항체 배양 후:

1
초기 세척:2차 항체 용액에서 멤브레인을 제거합니다. 과량의 용액을 배수합니다. 신선한 TBST(20-50 mL)에 놓습니다. 부드러운 흔들기로 각 5분씩 3-5회 세척하며, 각 세척 사이에 TBST를 교체합니다. 이것은 결합되지 않은 2차 항체를 제거합니다.
2
높은 배경을 위한 연장 세척:배경이 높은 경우, 각 10분씩 5-7회 세척으로 증가시키세요. 또는 더 엄격한 세척을 위해 TBST에 0.1% SDS를 추가하세요(100 mL TBST에 100 μL 10% SDS 추가). SDS는 비특이적으로 결합된 항체를 제거하는 데 도움이 됩니다.
3
최종 헹굼 (선택사항):화학발광 검출의 경우, TBS(Tween-20 없음)로 한 번의 최종 빠른 헹굼(30초 ~ 1분)을 수행하세요. 이것은 일부 ECL 기질을 방해할 수 있는 잔류 Tween-20을 제거합니다. 검출로 진행하기 전에 과량의 TBS를 배수하세요.

Tips:

2차 항체 세척이 더 중요합니다 - 결합되지 않은 2차 항체는 높은 배경을 일으킵니다
세척 중 배경을 모니터링하세요 - 5회 세척 후에도 여전히 높으면 세척을 연장하세요
형광 검출의 경우, 최종 TBS 헹굼은 일반적으로 필요하지 않습니다
과도하게 세척하지 마세요 - 과도한 세척은 특이적 신호를 감소시킬 수 있습니다

세척 최적화:

배경이 높은 경우:

세척 횟수 증가: 3-5회 대신 5-7회 세척
세척 지속 시간 증가: 세척당 5분 대신 10분
세척 버퍼에 0.1% SDS 추가: 0.1% SDS가 포함된 TBST 준비(100 mL TBST당 100 μL 10% SDS 추가)
최종 세척에 TBS 사용: 마지막 2-3회 세척에 TBST를 TBS(Tween-20 없음)로 교체
세척 부피 증가: 세척당 20-50 mL 대신 50-100 mL 사용
항체 농도 확인: 높은 배경은 항체 농도가 너무 높을 수 있음을 나타낼 수 있습니다

세척 후 신호가 약해지는 경우:

세척 횟수 감소: 5회 대신 3회 세척 시도
세척 지속 시간 감소: 세척당 5분 대신 3분 시도
항체 결합 확인: 약한 신호는 1차 항체 결합이 나쁠 수 있음을 나타낼 수 있습니다 - 양성 대조군으로 확인하세요
항체가 세척되지 않는지 확인: 일부 항체는 더 약한 결합을 가집니다 - 세척 강도 감소
검출 시약 확인: ECL 기질 또는 형광 검출 시약이 신선하고 작동하는지 확인하세요

검출 방법

장비 및 감도 요구사항에 따라 검출 방법을 선택하세요. 각 방법은 특정한 장점과 프로토콜을 가집니다.

화학발광 검출 - 상세 프로토콜

가장 민감한 방법으로 널리 사용됩니다. ECL 기질 및 X선 필름 또는 이미징 시스템이 필요합니다. 우수한 감도와 동적 범위를 제공합니다.

1
ECL 기질 준비:제조업체의 지침에 따라 ECL 기질 성분을 혼합합니다. 대부분의 ECL 키트는 사용 직전에 1:1로 혼합되는 두 가지 성분(루미놀 및 과산화물)을 가집니다. 동일한 부피를 혼합하고 즉시 사용하세요.
2
멤브레인 배양:멤브레인을 단백질 면이 위로 오도록 깨끗한 표면에 놓습니다. 멤브레인에 ECL 기질을 피펫팅하여 완전한 커버리지를 보장합니다. 실온에서 1-5분간 배양합니다. 더 긴 배양(최대 5분)은 신호를 증가시킬 수 있지만 배경도 증가시킬 수 있습니다.
3
과량의 기질 제거:멤브레인을 기울여 과량의 기질을 배수합니다. 멤브레인이 마르지 않도록 하세요. 플라스틱 랩으로 감싸거나 이미징 카세트에 놓습니다. 멤브레인과 랩 사이에 공기 거품이 없도록 하세요.
4
이미지 캡처:X선 필름의 경우: 신호 강도에 따라 1초에서 10분까지 필름을 노출합니다. 짧은 노출(1-5초)로 시작하고 조정하세요. 제조업체의 지침에 따라 필름을 현상합니다. CCD 카메라의 경우: 이미징 시스템에 놓고 이미지를 캡처합니다. 포화를 피하기 위해 노출 시간을 조정하세요.
5
다중 노출:선형 범위 내에서 강한 밴드와 약한 밴드를 모두 캡처하기 위해 다른 시간에 여러 번 노출합니다. 각 이미지의 노출 시간을 문서화하세요.

형광 검출 - 상세 프로토콜

형광 표지 2차 항체를 사용하는 정량적 방법. 필름이 필요 없으며, 다른 색상으로 다중 검출을 허용합니다.

1
2차 항체 선택:형광 표지 2차 항체를 사용하세요. 일반적인 옵션: IRDye 680/800 (LI-COR), Alexa Fluor 488/555/647 또는 DyLight 결합체. 여러 단백질을 검출하는 경우 겹치지 않는 파장을 선택하세요.
2
배양:항체 배양 섹션에 설명된 대로 형광 2차 항체와 배양합니다. 광표백을 방지하기 위해 배양 중 및 배양 후 빛으로부터 보호하세요.
3
세척:설명된 대로 TBST로 철저히 세척합니다. 최종 세척은 배경 형광을 감소시키기 위해 TBS로 할 수 있습니다.
4
스캔:형광체에 적합한 레이저 파장으로 멤브레인을 스캔합니다. IRDye의 경우: 680 nm 및 800 nm 채널. Alexa Fluor의 경우: 적절한 여기 파장을 사용하세요. 최적의 신호를 위해 레이저 전력 및 스캔 해상도를 조정하세요.
5
이미지 분석:이미징 소프트웨어를 사용하여 밴드 강도를 정량화합니다. 대부분의 시스템은 내장 정량화 도구를 제공합니다. 모든 밴드가 선형 검출 범위 내에 있는지 확인하세요.

비색 검출 - 상세 프로토콜

색상 밴드를 생성하는 발색 기질을 사용하는 간단한 방법. 특수 장비가 필요 없지만 다른 방법보다 덜 민감합니다.

1
기질 준비:제조업체의 지침에 따라 발색 기질을 준비합니다. DAB (3,3'-다이아미노벤지딘)는 갈색 밴드를 생성합니다. BCIP/NBT는 보라색/파란색 밴드를 생성합니다. TMB는 파란색 밴드를 생성합니다.
2
멤브레인 배양:멤브레인을 기질 용액에 놓습니다. 부드러운 흔들기로 실온에서 배양합니다. 신호 강도에 따라 5-30분 내에 밴드가 나타납니다.
3
반응 정지:밴드가 원하는 강도에 도달하면 물 또는 정지 용액(제공된 경우)으로 세척하여 반응을 정지합니다. DAB의 경우 물로 정지합니다. BCIP/NBT의 경우 밴드가 보일 때 물로 정지합니다.
4
즉시 문서화:스캔하거나 촬영하여 결과를 즉시 문서화하세요. 색상은 시간이 지나면서 사라질 수 있으며, 특히 일부 기질의 경우 그렇습니다.

웨스턴 블롯 정량화

정확한 정량화는 적절한 정규화 및 분석 방법이 필요합니다. 이 섹션은 웨스턴 블롯 결과를 정량화하는 상세한 프로토콜을 제공합니다.

ImageJ 분석 (무료, 오픈 소스):

1
ImageJ에서 이미지를 엽니다(파일 > 열기). 필요하면 8비트 또는 16비트 그레이스케일로 변환합니다(이미지 > 유형 > 8비트).
2
Rectangle 도구를 사용하여 첫 번째 밴드 주위에 사각형을 그립니다. 분석 > 겔 > 첫 번째 레인 선택(또는 '1' 키 누름)으로 이동합니다.
3
사각형을 다음 밴드로 이동하고 두 번째 레인에 대해 '2' 키를 누릅니다. 레인의 모든 밴드에 대해 반복합니다.
4
첫 번째 레인의 모든 밴드를 선택한 후 '3' 키를 눌러 다음 레인으로 이동합니다. 선택 과정을 반복합니다.
5
모든 밴드가 선택되면 분석 > 겔 > 레인 플롯으로 이동합니다. 이것은 강도 프로필을 생성합니다.
6
Wand 도구를 사용하여 피크를 선택하고 곡선 아래 영역(적분 밀도)을 측정합니다.
7
각 밴드에 대한 값을 기록합니다. 위에 설명된 대로 비율을 계산하고 정규화하세요.

정량화 팁 및 모범 사례

모든 샘플이 선형 검출 범위 내에 있는지 확인하세요 - 포화된 밴드는 정확하게 정량화할 수 없습니다
화학발광을 사용할 때 모든 샘플에 대해 동일한 노출 시간을 사용하세요 - 다른 노출은 비교를 무효화합니다
여러 생물학적 반복(최소 n=3)을 포함하세요 - 기술적 반복만으로는 충분하지 않습니다
적절한 통계 분석을 사용하세요 - 확실하지 않으면 생물통계학자와 상담하세요
모든 분석 매개변수(노출 시간, 소프트웨어 설정, 정규화 방법)를 문서화하세요
로딩 대조군이 실험 조건에 적절한지 확인하세요
로딩 대조군의 대안 또는 보완으로 총 단백질 정규화 사용을 고려하세요
조건 간에 로딩 대조군이 변하면 배수 변화가 과소평가될 수 있음을 인식하세요
출판을 위해 보충 자료에 원본 이미지 및 정량화 데이터를 포함하세요

웨스턴 블롯 문제 해결 가이드

웨스턴 블롯 실험에서 일반적인 문제 및 해결책.

신호 없음 또는 약한 신호

1차 항체 농도가 너무 낮음:

항체 농도를 증가시키거나 배양 시간을 연장하세요

단백질이 멤브레인으로 전사되지 않음:

Ponceau S로 멤브레인을 염색하여 전사 효율을 확인하세요. 전사 조건을 최적화하세요.

항체가 표적에 특이적이지 않음:

양성 및 음성 대조군으로 항체 특이성을 확인하세요

검출 시약이 만료되었거나 부적절하게 저장됨:

신선한 검출 시약을 사용하고, 제조업체의 지침에 따라 저장하세요

높은 배경

불충분한 차단:

차단 시간을 2시간까지 증가시키거나 더 높은 농도(10% 우유)를 사용하세요

항체 농도가 너무 높음:

항체를 더 희석하고, 적정을 통해 최적화하세요

불충분한 세척:

세척 횟수와 지속 시간을 증가시키고, 세척 버퍼에 0.1% SDS를 추가하세요

멤브레인 오염:

깨끗한 핀셋을 사용하고, 맨손으로 멤브레인을 만지지 마세요

비특이적 밴드

항체 교차 반응성:

더 특이적인 항체 또는 사전 흡착된 2차 항체를 사용하세요

단백질 분해:

신선한 샘플을 사용하고, 프로테아제 억제제를 추가하세요

불완전한 변성:

샘플이 95°C에서 5분간 가열되었는지 확인하세요

불완전한 전사

큰 단백질(>100 kDa)이 전사되지 않음:

전사 시간을 2-3시간까지 연장하고, 메탄올 농도를 10%로 감소시키고, 전사 버퍼에 0.1% SDS를 추가하거나, 더 낮은 전압(70-80V)을 더 오래 사용하세요. 0.2 μm 기공 크기 멤브레인 사용을 고려하세요.

작은 단백질(<20 kDa)이 멤브레인을 통과함:

전사 시간을 30-45분으로 감소시키고, 메탄올을 25%로 증가시키거나, 0.45 μm 대신 0.2 μm 기공 크기 멤브레인을 사용하세요. Ponceau S 염색으로 확인하세요.

멤브레인 전체에 걸쳐 불균일한 전사:

겔과 멤브레인 사이의 좋은 접촉을 보장하고, 테스트 튜브로 굴려 모든 공기 거품을 제거하고, 전사 스택이 적절히 조립되었는지 확인하고, 전사 중 버퍼가 잘 교반되는지 확인하세요

프로토콜 최적화 전략

최상의 결과를 위해 웨스턴 블롯 프로토콜을 최적화하는 체계적인 접근. 한 번에 하나의 매개변수를 변경하고 모든 변경사항을 문서화하세요. 이 포괄적인 가이드는 신호 대 잡음비를 향상시키고, 재현성을 개선하며, 출판 품질의 결과를 달성하기 위한 증거 기반 전략을 제공합니다.

샘플 최적화 - 상세 가이드

최대 단백질 수율과 품질을 보장하기 위해 샘플 준비를 최적화하세요. 샘플 최적화는 성공적인 웨스턴 블롯의 기초입니다 - 나쁜 샘플 품질은 후속 단계로 보상할 수 없습니다.

용해 버퍼 선택:

RIPA 버퍼: 가장 일반적, 대부분의 단백질에 좋음, 완전한 용해를 위한 계면활성제(NP-40, deoxycholate, SDS) 포함. 세포질 및 핵 단백질에 가장 적합. 일부 막 단백질에는 너무 강할 수 있음.
NP-40 버퍼: 더 온화함, 막 단백질 및 단백질 복합체에 좋음, 덜 변성적. RIPA보다 단백질-단백질 상호작용을 더 잘 보존함.
Laemmli 버퍼: 직접 용해, 별도의 용해 단계 불필요. 가장 빠른 방법이지만 모든 단백질을 효율적으로 추출하지 못할 수 있음.
Urea/Thiourea 버퍼: 용해하기 어려운 단백질, 특히 막 단백질용. 신중한 pH 조정 필요.
단백질에 가장 적합한 것을 찾기 위해 다른 버퍼를 체계적으로 테스트하세요

대부분의 응용에 대해 RIPA로 시작하세요. 신호가 약하거나 단백질이 분해된 것으로 보이면 NP-40을 테스트하세요. 막 단백질의 경우 먼저 NP-40을 시도하세요. 핵 단백질의 경우 더 강한 조건 또는 순차적 추출이 필요할 수 있습니다. 인산화된 단백질의 경우 포스파타제 억제제가 포함되었는지 확인하세요.

단백질 농도:

일반적인 로딩: 대부분의 응용에 대해 웰당 20-50 μg 총 단백질
높게 발현된 단백질(예: 액틴, 튜불린)의 경우: 10-20 μg이면 종종 충분함
낮은 풍부도의 단백질(예: 전사 인자, 키나제)의 경우: 50-100 μg이 필요할 수 있음
매우 낮은 풍부도의 단백질의 경우: 최대 150 μg이지만 번짐 및 인공물을 모니터링하세요
너무 많은 단백질(>100 μg)은 번짐, 낮은 분해능을 일으키고 검출을 포화시킬 수 있음
너무 적은 단백질(<10 μg)은 검출되지 않을 수 있으며, 특히 낮은 풍부도 표적의 경우

기준선으로 30 μg으로 시작하세요. 신호가 약하면 50-75 μg으로 증가시키세요. 밴드가 번지거나 분해능이 나쁘면 20-25 μg으로 감소시키세요. 정량적 비교의 경우, 모든 샘플이 동일한 단백질 농도를 가지는지 확인하세요. 정확한 정량화를 위해 BCA 또는 Bradford 분석을 사용하세요 - 추정하지 마세요.

샘플 버퍼 비율:

표준: 샘플 3부에 4X 샘플 버퍼 1부(최종 1X 농도)
농축된 샘플(>10 mg/mL)의 경우: 과농축을 피하기 위해 버퍼를 추가하기 전에 샘플을 희석해야 할 수 있음
희석된 샘플(<1 mg/mL)의 경우: 버퍼를 추가하기 전에 농축하거나 2X 샘플 버퍼를 사용해야 할 수 있음
적절한 변성을 위해 최종 SDS 농도가 충분한지(0.1-0.2%) 확인하세요
최종 글리세롤 농도(5-10%)는 샘플이 웰로 가라앉는 데 도움이 됩니다

밴드가 선명하지 않거나 단백질이 응집된 것으로 보이면 샘플 버퍼 비율을 증가시키거나 적절한 가열을 보장하세요. 샘플이 너무 점성이 있으면 적절히 희석하세요. 가열 직전에 항상 신선한 환원제(2-ME 또는 DTT)를 추가하세요.

가열 조건:

표준: 95°C에서 5분 - 대부분의 단백질에 작동하며, 완전한 변성을 보장함
대안: 70°C에서 10분 - 더 온화함, 95°C에서 응집되는 온도 민감한 단백질용
일부 단백질은 고온에서 응집될 수 있음 - 최적을 찾기 위해 60°C, 70°C, 80°C, 95°C를 테스트하세요
막 단백질의 경우: 때로는 37°C에서 30분이 고온보다 더 잘 작동함
가열을 건너뛰지 마세요 - 불완전한 변성은 나쁜 이동과 인공물을 일으킵니다

응집을 시사하는 여러 밴드나 번짐을 보면 더 낮은 온도를 테스트하세요. 밴드가 선명하지 않거나 이동이 일관되지 않으면 가열이 완료되었는지 확인하세요(샘플이 실제로 온도에 있는지 확인). 히트 블록 또는 수조를 사용하세요 - 마이크로웨이브 가열은 일관되지 않습니다.

억제제 추가:

사용 직전에 항상 신선한 억제제를 추가하세요 - 시간이 지나면서 분해됩니다
프로테아제 억제제: PMSF (1 mM) 또는 상용 칵테일(제조업체의 지침을 따르세요)
포스파타제 억제제: NaF (10-50 mM), Na3VO4 (1-2 mM) 또는 상용 칵테일
인산화된 단백질의 경우: 포스파타제 억제제가 중요합니다 - 즉시 용해 버퍼에 추가하세요
억제제 원액을 적절히 저장하세요: PMSF는 이소프로판올에, Na3VO4는 물에, 칵테일은 권장대로

분해 산물(여러 낮은 분자량 밴드)을 보면 프로테아제 억제제 농도를 증가시키거나 다른 억제제를 시도하세요. 인산화 신호가 약하거나 일관되지 않으면 포스파타제 억제제가 신선하고 올바른 농도인지 확인하세요.

겔 최적화 - 상세 가이드

최상의 단백질 분리를 위해 겔 조건을 최적화하세요. 겔 최적화는 분해능에 직접 영향을 미치며, 이는 특정 단백질을 검출하고 비특이적 밴드와 구별하는 능력을 결정합니다.

적절한 겔 최적화는 다음을 보장합니다: (1) 분자량에 기반한 최적 단백질 분리, (2) 선명하고 잘 분해된 밴드, (3) 표적 단백질에 대한 적절한 이동 거리, (4) 최소 인공물 및 번짐

겔 백분율:

겔 백분율은 기공 크기를 결정하고 단백질 이동에 직접 영향을 미칩니다. 최적의 백분율은 단백질이 최상의 분해능을 위해 분리 겔의 중간 1/3로 이동할 수 있게 합니다.

10% 겔로 시작하세요(가장 다용도, 30-100 kDa 단백질에 작동). <20 kDa 단백질의 경우 더 나은 분리를 위해 15-20%로 증가시키세요. >100 kDa 단백질의 경우 이동을 허용하기 위해 6-8%로 감소시키세요. 다른 백분율을 체계적으로 테스트하세요: 8%, 10%, 12%, 15% 겔을 준비하고 동일한 샘플을 실행하여 분해능을 비교하세요.

<20 kDa 단백질: 15-20% 겔을 사용하세요. 더 높은 백분율은 더 작은 기공을 생성하여 작은 단백질에 대해 더 나은 분리를 제공합니다. 예: 히스톤, 작은 펩타이드, 분해 산물.:

<20 kDa 단백질: 15-20% 겔을 사용하세요. 더 높은 백분율은 더 작은 기공을 생성하여 작은 단백질에 대해 더 나은 분리를 제공합니다. 예: 히스톤, 작은 펩타이드, 분해 산물.

20-100 kDa 단백질: 10-12% 겔을 사용하세요. 이것은 가장 일반적인 범위입니다. 예: 대부분의 신호 전달 단백질, 전사 인자, 대사 효소.:

20-100 kDa 단백질: 10-12% 겔을 사용하세요. 이것은 가장 일반적인 범위입니다. 예: 대부분의 신호 전달 단백질, 전사 인자, 대사 효소.

>100 kDa 단백질: 6-8% 겔을 사용하세요. 더 낮은 백분율은 더 큰 기공을 생성하여 큰 단백질이 이동할 수 있게 합니다. 예: 수용체, 큰 전사 인자, 구조 단백질.:

>100 kDa 단백질: 6-8% 겔을 사용하세요. 더 낮은 백분율은 더 큰 기공을 생성하여 큰 단백질이 이동할 수 있게 합니다. 예: 수용체, 큰 전사 인자, 구조 단백질.

단백질 크기를 모르는 경우: 10%로 시작하거나, 성공 가능성을 높이기 위해 그라디언트 겔(4-20% 또는 8-16%)을 사용하세요.:

단백질 크기를 모르는 경우: 10%로 시작하거나, 성공 가능성을 높이기 위해 그라디언트 겔(4-20% 또는 8-16%)을 사용하세요.

8%, 10%, 12%, 15% 겔을 준비하세요. 각각에 동일한 샘플을 로드하세요. 비교: (1) 밴드 선명도, (2) 이동 거리(표적은 겔의 중간 1/3에 있어야 함), (3) 다른 밴드와의 분리, (4) 분자량 마커의 분해능. 표적에 대해 최상의 분해능을 제공하는 백분율을 선택하세요.

그라디언트 겔:

그라디언트 겔은 겔 전체에 걸쳐 가변 기공 크기를 제공하여 넓은 분자량 범위에 걸친 단백질에 대해 더 나은 분해능을 제공합니다.

같은 겔에서 다른 크기의 여러 단백질을 검출할 때단백질 크기를 모르거나 변할 수 있을 때(예: 스플라이스 변이체)새로운 표적 단백질을 최적화할 때많은 단백질이 있는 복잡한 샘플(예: 전체 세포 용해물)용

겔 두께:

겔 두께는 단백질 용량, 분해능 및 취급 특성에 영향을 미칩니다.

최적화를 위해 1.0 mm로 시작하세요. 분해능이 나쁘고 샘플이 제한적이면 0.75 mm를 시도하세요. 신호가 약하고 더 많이 로드할 수 있으면 1.5 mm를 시도하세요.

1.0 mm: 표준 두께, 좋은 분해능, 취급하기 쉬움, 가장 일반적으로 사용됨 (표준 단백질 용량(웰당 일반적으로 20-50 μg)) - 대부분의 응용에 권장, 특히 최적화 중
1.5 mm: 더 많은 단백질 용량, 필요시 더 많은 샘플을 로드할 수 있음 (더 높은 단백질 용량(필요시 최대 100 μg까지 로드 가능)) - 약간 낮은 분해능, 더 두꺼운 겔은 더 느리게 실행됨 - 높은 양의 단백질을 로드해야 할 때(낮은 풍부도 표적)
0.75 mm: 더 높은 분해능, 더 빠른 실행, 작은 단백질에 더 좋음 (더 낮은 단백질 용량(웰당 일반적으로 10-30 μg)) - 더 취약함, 취급하기 어려움, 신중한 로딩 필요 - 고해상도 응용, 작은 단백질 또는 샘플이 제한적일 때

실행 조건:

전압 및 실행 시간은 분리 품질, 밴드 선명도 및 잠재적 인공물에 영향을 미칩니다.

기준선으로 100V 일정 전압으로 시작하세요. 밴드가 흐릿하거나 '웃음'(곡선 이동)을 보이면 80V로 감소시키고 더 오래 실행하세요. 실행이 너무 느리고 밴드가 선명하면 120V로 증가시킬 수 있지만 온도를 면밀히 모니터링하세요. 큰 단백질(>100 kDa)의 경우 과열을 방지하고 전사를 개선하기 위해 항상 더 낮은 전압(60-80V)을 사용하세요.

겔 준비 품질:

겔 준비의 품질은 분해능과 재현성에 직접 영향을 미칩니다.

일반적인 겔 문제 및 해결책:

밴드가 흐릿하거나 번짐:

Causes: 겔 실행이 너무 빠름, 과부하, 불완전한 중합, 온도가 너무 높음

Solutions: 전압 감소, 단백질 로딩 감소, 완전한 중합 보장, 냉각 사용

밴드가 불균일하게 이동함(웃음 효과):

Causes: 겔이 수평이 아님, 버퍼 수준이 불균일함, 온도 구배, 겔 두께 변화

Solutions: 겔 장치를 수평으로 하고, 균일한 버퍼 수준을 보장하고, 일관된 온도를 유지하고, 겔 두께를 확인하세요

낮은 분해능:

Causes: 잘못된 겔 백분율, 불완전한 중합, 실행이 너무 빠름, 겔이 너무 오래됨

Solutions: 다른 겔 백분율을 테스트하고, 완전한 중합을 보장하고, 전압을 감소시키고, 신선한 겔을 사용하세요

전사 최적화 - 상세 가이드