細胞溶解物の調製

培養細胞からタンパク質溶解物を調製するための詳細なプロトコル。適切な溶解条件は、タンパク質の完全性を維持し、分解を防ぐために不可欠です。

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   培養培地を除去し、氷冷PBS（リン酸緩衝生理食塩水）で細胞を2-3回洗浄します。溶解バッファーの希釈を避けるために、すべてのPBSが完全に除去されていることを確認してください。付着細胞の場合、PBSを直接ディッシュに添加します。懸濁細胞の場合、500-1000×gで5分間遠心分離して細胞をペレット化します。
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   新鮮な溶解バッファーを調製するか、-20°Cで保存された分注バッファーを使用します。使用直前にプロテアーゼ阻害剤（例：最終濃度1mMのPMSF、または市販のプロテアーゼ阻害剤カクテル）とホスファターゼ阻害剤（例：10mMのNaF、1mMのNa3VO4）を添加します。プロセス全体を通してバッファーを氷冷状態に保ちます。
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   適切な量の溶解バッファーを添加します（通常、10^6細胞あたり100-200μL、または培養ディッシュのcm²あたり100-150μL）。付着細胞の場合、セルスクレーパーを使用して溶解バッファー中で直接細胞をスクレープします。懸濁細胞の場合、ペレットを溶解バッファー中で再懸濁します。事前に冷却したマイクロ遠心管に移します。
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   氷上で20-30分間インキュベートし、5-10分ごとに時折軽くボルテックスします。溶解しにくい細胞の場合、インキュベーションを45分に延長するか、超音波処理を実行できます（氷上で10秒間のパルスを3-5回）。
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   4°Cで12,000-14,000×gで15分間遠心分離します。これにより、細胞破片、核、不溶性物質が除去されます。一部の用途では、より高速（20,000×g）で遠心分離するか、連続遠心分離を実行する必要がある場合があります。
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   ペレットを乱さずに上清を注意深く収集します。新しい事前冷却したチューブに移します。不溶性凝集体が含まれている可能性があり、電気泳動を妨げる可能性があるため、ペレット材料の収集を避けてください。
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   BCA、Bradford、またはLowryアッセイを使用してタンパク質濃度を決定します。常にBSA標準を使用して標準曲線を調製します。必要に応じて、アッセイの線形範囲内に収まるようにサンプルを希釈します。細胞溶解物の典型的な濃度範囲は1-10mg/mLです。

組織サンプルの調製

組織サンプルからタンパク質抽出物を調製するためのプロトコル。組織の均質化には、細胞溶解よりもより強力な方法が必要です。

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   新鮮な組織を収集し、すぐに氷上に置くか、液体窒素でフラッシュフリーズします。凍結組織の場合、処理の準備ができるまで凍結状態を保ちます。冷却した表面でメスまたはカミソリの刃を使用して、組織を小さな断片（2-3mm³）に切ります。
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   氷冷溶解バッファー中で組織を均質化します（通常、組織重量あたり10-20容量のバッファー、例：100mg組織を1-2mLバッファー中）。機械的均質化器、乳鉢と乳棒、またはビードビーティングシステムを使用します。硬い組織の場合、冷却間隔を置いて複数の短いバースト（各10-15秒）で均質化を実行します。
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   氷上で30分間均質物をインキュベートし、時折ボルテックスします。線維性組織の場合、インキュベーションを45-60分に延長します。一部の組織は、短い超音波処理（氷上で各5秒のパルスを3-5回）の恩恵を受ける場合があります。
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   4°Cで12,000-14,000×gで20分間遠心分離します。高脂質含有組織の場合、より高速で遠心分離するか、追加の遠心分離ステップを実行する必要がある場合があります。
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   上清に目に見える破片が含まれているか、濁っている場合、0.45μmシリンジフィルターでろ過するか、再度遠心分離します。一部のプロトコルでは、チーズクロスまたは細かいメッシュでろ過することを推奨しています。
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   タンパク質濃度を決定します。組織抽出物は通常、細胞溶解物よりも高いタンパク質濃度（5-20mg/mL）を持ちます。定量アッセイに必要な希釈を行います。

• 30% Acrylamide/Bis solution (29:1 or 37.5:1 ratio)
• 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 (for resolving gel)
• 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 (for stacking gel)
• 10% SDS (sodium dodecyl sulfate)
• 10% APS (ammonium persulfate) - prepare fresh
• TEMED（N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン）
• Deionized water
• Gel casting system (glass plates, spacers, combs)
• Isopropanol or water-saturated butanol (for overlay)

分離ゲル調製（10%の例）：

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   容量を計算:10%分離ゲル（合計10mL）の場合：3.3mLの30%アクリルアミド、2.5mLの1.5M Tris-HCl pH 8.8、0.1mLの10% SDS、4.05mLの脱イオン水を混合します。真空下で10-15分間脱ガスして溶解酸素を除去します。
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   重合剤を添加:50μLの10% APSと10μLのTEMEDを添加します。軽く旋回して混合します（泡を導入するため、ボルテックスしないでください）。すぐにゲルカセットに、コームが座る位置の約1cm下まで注ぎます。
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   オーバーレイ:酸素接触を防ぎ、平らなゲル表面を作成するために、イソプロパノールまたは水飽和ブタノールで注意深くオーバーレイします。室温で30-45分間重合させます。重合が完了すると、明確な界面が見えます。
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   オーバーレイを除去:オーバーレイを注ぎ出し、脱イオン水でゲルの上部をすすぎます。フィルターペーパーで上面を乾燥させますが、ゲルに触れないように注意してください。

スタッキングゲル調製（5%）：

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   スタッキングゲル溶液を調製:5%スタッキングゲル（合計4mL）の場合：0.67mLの30%アクリルアミド、1.0mLの0.5M Tris-HCl pH 6.8、0.04mLの10% SDS、2.25mLの脱イオン水を混合します。時間があれば脱ガスします。
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   重合剤を添加:25μLの10% APSと5μLのTEMEDを添加します。軽く混合し、すぐに分離ゲルの上に注ぎます。
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   コームを挿入:泡を避けるために角度をつけてコームを素早く挿入し、次にまっすぐにします。20-30分間重合させます。コームの歯に明確な線が見えると、ゲルは準備完了です。
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   コームを除去:コームを注意深く除去し、実行バッファーまたは脱イオン水でウェルをすすいで、未重合のアクリルアミドを除去します。ゲルはサンプルローディングの準備ができています。

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   ウェルあたり20-50μgのタンパク質を含むLaemmliサンプルバッファー（最終濃度1X）でサンプルを調製します。高発現タンパク質の場合、10-20μgを使用します。低存在量タンパク質の場合、50-100μgが必要な場合があります。
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   少なくとも1つのウェルに分子量マーカーを含めます。事前染色マーカーにより、電気泳動中に進行状況を監視できます。
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   ピペットを使用してサンプルを注意深くロードし、泡を避けます。隣接するウェルにサンプルが溢れないように、ゆっくりとロードします。
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   均一な電流分布を確保するために、空のウェルを1Xサンプルバッファーで満たします。

PVDF膜（推奨）：

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   膜をサイズに切ります（ゲルよりわずかに大きい）
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   100%メタノールに30秒間浸して膜を活性化します
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   転写バッファーに移し、5分間平衡化します
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   PVDF膜はニトロセルロースよりも優れたタンパク質結合能力と耐久性を持っています

最も一般的に使用される方法で、すべてのサイズのタンパク質に対して優れた転写効率を提供します。大きなタンパク質（>100kDa）に最適です。

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   ゲル平衡化:電気泳動後、プレートからゲルを注意深く取り出します。転写バッファーでゲルを15-30分間平衡化します。これにより、過剰なSDSが除去され、転写効率が向上します。平衡化中は軽く振とうします。
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   膜調製:PVDFの場合：サイズに切る、100%メタノールに30秒間浸して活性化、次に転写バッファーで5分間平衡化。ニトロセルロースの場合：サイズに切り、転写バッファーに直接5分間濡らします。
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   転写スタック組立:転写バッファーで満たしたトレイで組立ます。カソードからアノードへ：スポンジ、フィルターペーパー3枚、ゲル（裏向き）、膜（ゲルの上）、フィルターペーパー3枚、スポンジ。テストチューブで転がしてすべての気泡を除去します。
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   転写実行:カセットを転写タンクに配置し、氷または冷却システムで4°Cに保ちます。大きなタンパク質（>100kDa）の場合：70-80Vで2-3時間。中程度のタンパク質（30-100kDa）の場合：100Vで1時間。小さなタンパク質（<30kDa）の場合：100Vで45-60分。
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   転写確認:転写後、膜を取り出し、Ponceau Sで染色して転写効率を確認します。すべてのバンドが転写されていることを確認してください。

最小限のバッファーを使用する高速方法。小さなから中程度のタンパク質（<100kDa）に適しています。大きなタンパク質には効率が低いです。

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   バッファー調製:アノードバッファーを調製：0.3M Tris、20%メタノール、pH 10.4。カソードバッファーを調製：25mM Tris、40mMグリシン、10%メタノール、0.01% SDS、pH 9.4。各バッファーに3枚のフィルターペーパーを浸します。
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   アノード上のスタック組立:アノードプレート上：アノードバッファーに浸したフィルターペーパー3枚を配置します。活性化されたPVDF膜（または濡らしたニトロセルロース）を上に配置します。転がして気泡を除去します。
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   ゲルを配置:平衡化されたゲルを膜の上に注意深く配置します。良好な接触を確保し、転がしてすべての気泡を除去します。
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   カソードスタックを追加:カソードバッファーに浸したフィルターペーパー3枚をゲルの上に配置します。転がして気泡を除去します。
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   転写実行:カソードプレートを配置し、15Vで30-60分間転写します。温度を監視し、過熱を防ぎます。

ブロッキングは、非特異的抗体結合を防ぎ、背景信号を低減するために不可欠です。適切なブロッキング溶液と条件を選択することが重要です。

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   転写後の膜処理:転写後、必要に応じてPonceau Sで染色して転写を確認します。その後、TBSTで膜を洗浄してPonceau Sを除去します。
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   ブロッキング溶液の添加:膜をブロッキング溶液中に浸し、室温で1時間、または4°Cで一晩、軽く振とうしながらインキュベートします。膜が完全に覆われていることを確認します。
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   ブロッキングの確認:ブロッキング後、TBSTで膜を3回、各5分間洗浄します。これにより、未結合のブロッキング剤が除去されます。

一次抗体はターゲットタンパク質に特異的に結合します。適切な希釈とインキュベーション条件が重要です。

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   抗体希釈の計算と調製:膜サイズに基づいて必要な量を決定します：ミニゲル（8 x 10cm）には5-10mL、より大きな膜には15-20mLが必要です。必要な抗体量を計算します。例：5mL中1:1000希釈の場合、5mLブロッキング溶液に5μL一次抗体ストックを添加します。正確な量にはマイクロピペットを使用します。上下にピペッティングするか、容器を5-10回反転して軽く混合します。泡立ちや変性を引き起こす可能性があるため、ボルテックスしないでください。
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   膜を抗体溶液に転送:ブロッキング後、余分なブロッキング溶液を排出します（膜を乾燥させないでください）。膜をタンパク質側を上にして一次抗体溶液中に置きます。膜が完全に覆われ、浸されていることを確認します。小さな膜の場合、密封可能な袋（密封前に気泡を除去）または小さな容器を使用します。より大きな膜の場合、完全に覆うのに十分な溶液があるトレイまたは容器を使用します。容器に抗体名、希釈、日付をラベル付けします。
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   選択した温度でインキュベート:一晩インキュベーション（推奨）の場合：冷蔵庫または冷蔵室（4°C）に軽く振とうまたはロッキング（20-30rpm）しながら12-16時間置きます。蒸発を防ぐために容器が密封されていることを確認します。室温インキュベーションの場合：室温（20-25°C）のロッカーに軽く振とうしながら1-2時間置きます。温度を監視します - 過熱を避けます。一晩インキュベーションは通常、より良い信号対雑音比を提供します。
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   抗体溶液を保存（オプション）:インキュベーション後、一次抗体溶液は再利用のために保存できます。細菌の成長を防ぐために0.02%アジ化ナトリウム（5mL溶液あたり10%アジ化ナトリウム10μLを添加）を添加します。密封容器に4°Cで保存します。抗体名、希釈、日付、使用回数をラベル付けします。ほとんどの抗体は2-3回再利用できますが、使用ごとに信号が低下する可能性があります。汚染が疑われる場合は廃棄します。
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   膜を除去して洗浄に進む:清潔なピンセットを使用して、抗体溶液から膜を注意深く除去します。端をペーパータオルに触れて余分な溶液を排出します。膜を乾燥させないでください。すぐに洗浄ステップに進みます。この時点まで膜を洗浄しないでください - 一次抗体インキュベーション前の洗浄は不要で、信号を低減する可能性があります。

二次抗体は検出分子（HRP、蛍光色素）に結合され、一次抗体に結合します。

二次抗体は一次抗体を認識して結合し、結合した酵素（HRP）または蛍光タグを通じて検出を可能にします。適切な選択、希釈、およびインキュベーション条件は、最適な信号対雑音比にとって重要です。常に種特異的な二次抗体を使用し（ウサギ一次抗体には抗ウサギ、マウス一次抗体には抗マウス）、各実験で新鮮な溶液を調製します。

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   二次抗体溶液の調製:必要な量を計算します（ミニゲルには5-10mL）。清潔な容器に適切な量のブロッキング溶液を添加します。マイクロピペットを使用して、計算された量の二次抗体ストックを添加します。5mL中1:5000希釈の場合：1μL抗体を添加します。上下にピペッティングするか、容器を5-10回反転して軽く混合します。ボルテックスしないでください。容器に抗体名、希釈、日付をラベル付けします。
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   膜を二次抗体溶液に転送:一次抗体の洗浄後、余分なTBSTを排出します。膜をタンパク質側を上にして二次抗体溶液中に置きます。膜が完全に覆われていることを確認します。
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   室温でインキュベート:容器をロッカーまたはシェーカーに置き、軽い速度（20-30rpm）に設定します。室温（20-25°C）で1時間インキュベートします。蛍光抗体を使用する場合、容器をアルミホイルで包むか、暗箱に置いて光から保護します。温度を監視します - 背景を増加させる可能性がある過熱を避けます。信号を改善せずに背景を増加させるため、インキュベーションを1.5時間を超えて延長しないでください。
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   最終洗浄:インキュベーション後、膜をTBSTで3-5回、各5分間洗浄します。未結合の二次抗体を完全に除去します。最終洗浄後、余分なTBSTを排出します。検出に進む準備ができています。

洗浄 - 詳細プロトコル

徹底的な洗浄により、未結合の抗体が除去され、背景信号が低減されます。

適切な洗浄は、未結合の一次抗体と二次抗体を除去するために重要であり、背景信号を大幅に低減し、信号対雑音比を改善します。洗浄は徹底的である必要がありますが、過剰であってはなりません。過剰な洗浄は特異的信号を低減する可能性があります。各洗浄に新鮮なTBSTを使用し、膜を完全に覆うのに十分な量を確保します。

最も感度の高い方法で、広く使用されています。ECL基質とX線フィルムまたはイメージングシステムが必要です。優れた感度とダイナミックレンジを提供します。

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   ECL基質の調製:メーカーの指示に従ってECL基質成分を混合します。ほとんどのECLキットには2つの成分（ルミノールと過酸化水素）があり、使用直前に1:1で混合します。等量を混合し、すぐに使用します。
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   膜をインキュベート:膜をタンパク質側を上にして清潔な表面に置きます。ECL基質を膜にピペットで添加し、完全に覆われていることを確認します。室温で1-5分間インキュベートします。より長いインキュベーション（最大5分）は信号を増加させる可能性がありますが、背景も増加させる可能性があります。
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   余分な基質を除去:膜を傾けて余分な基質を排出します。膜を乾燥させないでください。プラスチックラップで包むか、イメージングカセットに置きます。膜とラップの間に気泡がないことを確認します。
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   画像キャプチャ:X線フィルムの場合：信号強度に応じて1秒から10分間フィルムを露出します。短い露出（1-5秒）から開始し、調整します。メーカーの指示に従ってフィルムを現像します。CCDカメラの場合：イメージングシステムに配置し、画像をキャプチャします。飽和を避けるために露出時間を調整します。
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   複数の露出:強いバンドと弱いバンドの両方を線形範囲内でキャプチャするために、異なる時間で複数の露出を取得します。各画像の露出時間を記録します。

定量的で、フィルムが不要です。多重検出が可能です。専用のイメージングシステムが必要です。

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   二次抗体の選択:蛍光標識二次抗体を使用します。一般的なオプション：IRDye 680/800（LI-COR）、Alexa Fluor 488/555/647、またはDyLight結合体。複数のタンパク質を検出する場合、重複しない波長を選択します。
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   インキュベーション:抗体インキュベーションセクションで説明されているように、蛍光二次抗体で膜をインキュベートします。光退色を防ぐために、インキュベーション中および後に光から保護します。
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   洗浄:説明されているように、TBSTで徹底的に洗浄します。最終洗浄はTBSで行い、背景蛍光を低減できます。
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   スキャン:蛍光色素に適したレーザー波長で膜をスキャンします。IRDyeの場合：680nmと800nmチャネル。Alexa Fluorの場合：適切な励起波長を使用します。最適な信号のためにレーザー出力とスキャン解像度を調整します。
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   画像解析:イメージングソフトウェアを使用してバンド強度を定量します。ほとんどのシステムには組み込みの定量ツールが提供されています。すべてのバンドが線形検出範囲内にあることを確認します。

ImageJ Analysis (Free, Open Source):

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   ImageJで画像を開きます（ファイル > 開く）。必要に応じて8ビットまたは16ビットグレースケールに変換します（画像 > タイプ > 8ビット）。
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   Rectangleツールを使用して最初のバンドの周りに四角形を描きます。分析 > ゲル > 最初のレーンを選択（または「1」を押す）に移動します。
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   四角形を次のバンドに移動し、「2」を押して2番目のレーンにします。レーン内のすべてのバンドについて繰り返します。
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   最初のレーン内のすべてのバンドを選択した後、「3」を押して次のレーンに移動します。選択プロセスを繰り返します。
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   すべてのバンドが選択されたら、分析 > ゲル > レーンをプロットに移動します。これにより強度プロファイルが作成されます。
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   Wandツールを使用してピークを選択し、曲線下面積（統合密度）を測定します。
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   各バンドの値を記録します。上記のように比率を計算し、正規化します。

不完全な転写

サンプル最適化 - 詳細ガイド

最大のタンパク質収量と品質を確保するためにサンプル調製を最適化します。サンプル最適化は成功したウェスタンブロッティングの基礎です - サンプル品質が悪いと、後のステップで補償できません。

ゲル最適化 - 詳細ガイド

最適なタンパク質分離のためにゲル条件を最適化します。ゲル最適化は分解能に直接影響し、特定のタンパク質を検出し、非特異的バンドと区別する能力を決定します。

適切なゲル最適化により以下が確保されます：(1) 分子量に基づく最適なタンパク質分離、(2) シャープで分解能の高いバンド、(3) ターゲットタンパク質の適切な移動距離、(4) 最小限のアーティファクトとスミアリング

膜への完全なタンパク質転写を確保するために転写条件を最適化します。転写効率は重要です - 完璧なゲル分離でも、タンパク質が膜に転写されなければ無意味です。

最適な転写により以下が確保されます：(1) 膜への最大のタンパク質転写、(2) タンパク質サイズと修飾の保持、(3) 膜全体にわたる均一な転写、(4) 最小限のアーティファクトと損傷

抗体最適化 - 詳細ガイド

最良の信号対雑音比のために抗体条件を系統的に最適化します。抗体最適化は最終結果に最大の影響を与えます - 適切な最適化により、信号対雑音比を10-100倍改善できます。

抗体最適化は以下に直接影響します：(1) 信号強度 - ターゲットが検出可能かどうかを決定します、(2) 背景レベル - データ品質と解釈に影響します、(3) 特異性 - 非特異的バンドを低減します、(4) 再現性 - 一貫した条件は一貫した結果をもたらします