Western Blot Hub

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Une préparation appropriée des échantillons est cruciale pour un western blot réussi. Cette section couvre les méthodes détaillées pour préparer des échantillons à partir de différentes sources avec des instructions étape par étape.

Préparation de Lysat Cellulaire

Protocole détaillé pour préparer des lysats protéiques à partir de cellules cultivées. Des conditions de lyse appropriées sont essentielles pour maintenir l'intégrité des protéines et prévenir la dégradation.

1
Retirez le milieu de culture et lavez les cellules 2-3 fois avec du PBS froid (solution saline tamponnée au phosphate). Assurez-vous que tout le PBS est complètement retiré pour éviter la dilution du tampon de lyse. Pour les cellules adhérentes, ajoutez le PBS directement à la boîte. Pour les cellules en suspension, pelletisez les cellules par centrifugation à 500-1000 × g pendant 5 minutes.
2
Préparez le tampon de lyse frais ou utilisez un tampon aliquoté stocké à -20°C. Ajoutez des inhibiteurs de protéase (par exemple, PMSF à 1 mM de concentration finale, ou cocktail d'inhibiteurs de protéase commercial) et des inhibiteurs de phosphatase (par exemple, NaF à 10 mM, Na3VO4 à 1 mM) juste avant utilisation. Gardez le tampon froid tout au long du processus.
3
Ajoutez un volume approprié de tampon de lyse (typiquement 100-200 μL par 10^6 cellules ou 100-150 μL par cm² de boîte de culture). Pour les cellules adhérentes, grattez les cellules directement dans le tampon de lyse en utilisant un grattoir cellulaire. Pour les cellules en suspension, remettez le culot en suspension dans le tampon de lyse. Transférez dans un tube de microcentrifugeuse pré-refroidi.
4
Incubez sur glace pendant 20-30 minutes avec vortexage doux occasionnel toutes les 5-10 minutes. Pour les cellules difficiles à lyser, vous pouvez prolonger l'incubation à 45 minutes ou effectuer une sonication (3-5 impulsions de 10 secondes chacune sur glace).
5
Centrifugez à 12 000-14 000 × g pendant 15 minutes à 4°C. Cela élimine les débris cellulaires, les noyaux et le matériau insoluble. Pour certaines applications, vous devrez peut-être centrifuger à des vitesses plus élevées (20 000 × g) ou effectuer des centrifugations séquentielles.
6
Recueillez soigneusement le surnageant sans perturber le culot. Transférez dans un nouveau tube pré-refroidi. Évitez de recueillir tout matériau de culot car il peut contenir des agrégats insolubles qui peuvent interférer avec l'électrophorèse.
7
Déterminez la concentration protéique en utilisant le dosage BCA, Bradford ou Lowry. Préparez toujours une courbe standard en utilisant des standards BSA. Diluez les échantillons si nécessaire pour qu'ils tombent dans la plage linéaire du dosage. Les concentrations typiques vont de 1-10 mg/mL pour les lysats cellulaires.

Tips:

Travaillez rapidement et gardez tout sur glace pour prévenir la dégradation des protéines
Utilisez des inhibiteurs de protéase frais car ils se dégradent avec le temps
Pour les protéines phosphorylées, les inhibiteurs de phosphatase sont essentiels
Évitez le vortexage excessif qui peut causer de la mousse et la dénaturation des protéines
Stockez les lysats à -80°C s'ils ne sont pas utilisés immédiatement

Préparation d'Échantillons de Tissu

Protocole pour préparer des extraits protéiques à partir d'échantillons de tissu. L'homogénéisation des tissus nécessite des méthodes plus vigoureuses que la lyse cellulaire.

1
Collectez le tissu frais et placez-le immédiatement sur glace ou congelez-le rapidement dans l'azote liquide. Pour les tissus congelés, gardez-les congelés jusqu'à ce qu'ils soient prêts à être traités. Coupez le tissu en petits morceaux (2-3 mm³) en utilisant un scalpel ou une lame de rasoir sur une surface refroidie.
2
Homogénéisez le tissu dans un tampon de lyse froid (typiquement 10-20 volumes de tampon par poids de tissu, par exemple, 100 mg de tissu dans 1-2 mL de tampon). Utilisez un homogénéisateur mécanique, un mortier et un pilon, ou un système de battage de billes. Pour les tissus durs, effectuez l'homogénéisation en plusieurs courtes impulsions (10-15 secondes chacune) avec des intervalles de refroidissement.
3
Incubez l'homogénat sur glace pendant 30 minutes avec vortexage occasionnel. Pour les tissus fibreux, prolongez l'incubation à 45-60 minutes. Certains tissus peuvent bénéficier d'une sonication brève (3-5 impulsions de 5 secondes chacune sur glace).
4
Centrifugez à 12 000-14 000 × g pendant 20 minutes à 4°C. Pour les tissus à forte teneur en lipides, vous devrez peut-être centrifuger à des vitesses plus élevées ou effectuer une étape de centrifugation supplémentaire.
5
Si le surnageant contient des débris visibles ou est trouble, filtrez à travers un filtre à seringue de 0,45 μm ou centrifugez à nouveau. Certains protocoles recommandent de filtrer à travers de la mousseline ou un tamis fin.
6
Déterminez la concentration protéique. Les extraits de tissu ont typiquement des concentrations protéiques plus élevées (5-20 mg/mL) que les lysats cellulaires. Diluez si nécessaire pour le dosage de quantification.

Tips:

Gardez le tissu congelé jusqu'au traitement pour prévenir la dégradation des protéines
Utilisez une méthode d'homogénéisation appropriée pour le type de tissu
Certains tissus peuvent nécessiter des étapes supplémentaires pour éliminer les lipides ou le tissu conjonctif
Stockez les extraits à -80°C en aliquotes pour éviter les cycles de gel-dégel

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Quantification des Protéines

Une quantification précise des protéines est essentielle pour charger des quantités égales de protéines. Utilisez le dosage BCA, Bradford ou Lowry selon les instructions du fabricant. Préparez toujours une courbe standard pour une quantification précise.

Électrophorèse SDS-PAGE

SDS-PAGE sépare les protéines en fonction du poids moléculaire. Une préparation appropriée du gel et des conditions d'exécution sont critiques pour la résolution. Cette section fournit des instructions détaillées étape par étape pour préparer et exécuter des gels SDS-PAGE.

Matériaux Requis :

View Running Conditions Guide →

Solution Acrylamide/Bis à 30% (rapport 29:1 ou 37.5:1)
Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8 (pour le gel de résolution)
Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8 (pour le gel de concentration)
SDS à 10% (dodécylsulfate de sodium)
APS à 10% (persulfate d'ammonium) - préparer frais
TEMED (N,N,N',N'-Tétraméthyléthylènediamine)
Eau déionisée
Système de coulée de gel (plaques de verre, espaceurs, peignes)
Isopropanol ou butanol saturé d'eau (pour la superposition)

Préparation du Gel de Résolution (exemple 10%) :

1
Calculer les Volumes:Pour un gel de résolution à 10% (10 mL total) : Mélangez 3,3 mL d'acrylamide 30%, 2,5 mL de Tris-HCl 1,5 M pH 8,8, 0,1 mL de SDS 10%, 4,05 mL d'eau déionisée. Dégazez sous vide pendant 10-15 minutes pour éliminer l'oxygène dissous.
2
Ajouter les Agents de Polymérisation:Ajoutez 50 μL d'APS 10% et 10 μL de TEMED. Mélangez doucement en tournant (ne pas vortexer car cela introduit des bulles). Versez immédiatement dans la cassette de gel à environ 1 cm en dessous de l'endroit où le peigne sera placé.
3
Superposition:Superposez soigneusement avec de l'isopropanol ou du butanol saturé d'eau pour empêcher le contact avec l'oxygène et créer une surface de gel plane. Laissez polymériser pendant 30-45 minutes à température ambiante. Vous verrez une interface claire lorsque la polymérisation est terminée.
4
Retirer la Superposition:Versez la superposition et rincez le haut du gel avec de l'eau déionisée. Séchez la surface supérieure avec du papier filtre, en veillant à ne pas toucher le gel.

Lignes Directrices pour le Pourcentage de Gel :

6-8% : Pour les protéines >100 kDa (grandes protéines)
10% : Pour les protéines 30-100 kDa (le plus courant, polyvalent)
12% : Pour les protéines 15-60 kDa
15% : Pour les protéines 10-40 kDa
18-20% : Pour les protéines <20 kDa (petites protéines)

Stacking Gel Preparation (5%):

1
Préparer la Solution de Gel de Concentration:Pour un gel de concentration à 5% (4 mL au total) : Mélangez 0,67 mL d'acrylamide à 30%, 1,0 mL de Tris-HCl 0,5 M pH 6,8, 0,04 mL de SDS à 10%, 2,25 mL d'eau désionisée et 0,04 mL de glycérol (optionnel).
2
Ajouter les Agents de Polymérisation:Ajoutez 25 μL d'APS à 10% et 5 μL de TEMED. Mélangez doucement et versez immédiatement sur le gel de séparation.
3
Insérer le Peigne:Insérez rapidement le peigne en biais pour éviter les bulles, puis redressez-le. Laissez polymériser pendant 20-30 minutes à température ambiante.
4
Retirer le Peigne:Retirez soigneusement le peigne et rincez les puits avec le tampon de migration ou de l'eau désionisée pour éliminer l'acrylamide non polymérisé.

Chargement des Échantillons :

1
Préparez les échantillons dans le tampon d'échantillon Laemmli (concentration finale 1X) avec 20-50 μg de protéines par puits. Pour les protéines hautement exprimées, utilisez 10-20 μg. Pour les protéines de faible abondance, vous pourriez avoir besoin de 50-100 μg.
2
Incluez des marqueurs de poids moléculaire dans au moins un puits. Les marqueurs pré-colorés vous permettent de surveiller la progression pendant l'électrophorèse.
3
Chargez les échantillons soigneusement en utilisant une pipette, en évitant les bulles. Chargez lentement pour empêcher les échantillons de déborder dans les puits adjacents.
4
Remplissez tous les puits vides avec le tampon d'échantillon 1X pour assurer une distribution uniforme du courant.

Conseils pour une Meilleure Résolution

Utilisez de l'APS et du TEMED frais pour la polymérisation du gel - les réactifs anciens peuvent ne pas fonctionner correctement
Dégazez la solution de gel avant d'ajouter l'APS pour empêcher les bulles qui peuvent perturber la structure du gel
Laissez le gel polymériser complètement avant utilisation - une polymérisation incomplète cause une mauvaise résolution
Utilisez un pourcentage de gel approprié pour la taille de votre protéine - un mauvais pourcentage conduit à une mauvaise séparation
Maintenez une température constante pendant l'électrophorèse - les fluctuations de température affectent la migration
Assurez-vous que les niveaux de tampon sont adéquats - un tampon faible cause une exécution inégale
Utilisez un tampon d'exécution frais - un tampon ancien peut avoir un pH ou une conductivité incorrects
Évitez la surcharge des échantillons - trop de protéines cause un étalement des bandes
Chargez des volumes égaux lorsque possible - différents volumes peuvent causer une distorsion des voies

Méthodes de Transfert de Protéines

Le transfert des protéines du gel vers la membrane est une étape critique qui détermine la sensibilité de détection. Cette section fournit des protocoles détaillés pour différentes méthodes de transfert.

Membrane PVDF (Recommandée) :

1
Coupez la membrane à la taille (légèrement plus grande que le gel)
2
Activez la membrane en l'immergeant dans du méthanol 100% pendant 30 secondes
3
Transférez dans le tampon de transfert et équilibrez pendant 5 minutes
4
Les membranes PVDF ont une meilleure capacité de liaison protéique et une meilleure durabilité que la nitrocellulose

Transfert Humide - Protocole Détaillé

Méthode la plus couramment utilisée, fournit une excellente efficacité de transfert pour les protéines de toutes tailles. Meilleur pour les grandes protéines (>100 kDa).

Matériaux Requis :

Tampon de transfert (25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% méthanol pour PVDF)
Membrane PVDF ou nitrocellulose
Papier filtre (Whatman 3MM ou équivalent)
Éponges ou coussinets de transfert
Cassette de transfert
Réservoir de transfert avec système de refroidissement
Glace ou pack froid

1
Équilibration du Gel:Après l'électrophorèse, retirez soigneusement le gel des plaques. Équilibrez le gel dans le tampon de transfert pendant 15-30 minutes. Cela élimine l'excès de SDS et améliore l'efficacité du transfert. Agitez doucement pendant l'équilibration.
2
Préparation de la Membrane:Pour PVDF : Coupez à la taille, activez dans du méthanol 100% pendant 30 secondes, puis équilibrez dans le tampon de transfert pendant 5 minutes. Pour nitrocellulose : Coupez à la taille et mouillez directement dans le tampon de transfert pendant 5 minutes.
3
Montage de la Pile de Transfert:Montez la pile de transfert dans une cuvette remplie de tampon de transfert. De la cathode (noire, négative) à l'anode (rouge, positive) : (1) Éponge, (2) 3 papiers filtre, (3) Gel (face vers le bas), (4) Membrane (sur le gel), (5) 3 papiers filtre, (6) Éponge. Retirez TOUTES les bulles d'air en roulant avec un tube à essai ou en utilisant un rouleau. Les bulles d'air empêchent le transfert de protéines à cet endroit.
4
Conditions de Transfert:Placez la cassette dans le réservoir de transfert rempli de tampon de transfert froid. Assurez-vous que le tampon couvre la cassette. Pour les transferts standard : 100V pendant 1 heure à 4°C (avec glace ou système de refroidissement). Pour les grandes protéines : 70-80V pendant 2-3 heures. Pour la nuit : 30V pendant la nuit à 4°C. Assurez-vous que le tampon est froid et bien agité pendant le transfert.
5
Vérification du Transfert:Après le transfert, vérifiez l'efficacité en colorant la membrane avec Ponceau S (0,1% dans 5% d'acide acétique) pendant 2-5 minutes. Rincez avec de l'eau pour visualiser les bandes protéiques. Cela confirme un transfert réussi avant de procéder au blocage. Le Ponceau S peut être lavé avec TBST avant le blocage.

Transfert Semi-Sec - Protocole Détaillé

Méthode plus rapide utilisant un tampon minimal. Adaptée aux petites à moyennes protéines (<100 kDa). Moins efficace pour les grandes protéines.

1
Préparation du Tampon:Préparez le tampon anode : 0,3 M Tris, 20% méthanol, pH 10,4. Préparez le tampon cathode : 25 mM Tris, 40 mM glycine, 10% méthanol, 0,01% SDS, pH 9,4. Imbibez 3 papiers filtre dans chaque tampon.
2
Montage de la Pile sur l'Anode:Sur la plaque anode : Placez 3 papiers filtre imbibés de tampon anode. Placez la membrane PVDF activée sur le dessus (ou nitrocellulose mouillée). Retirez les bulles d'air en roulant.
3
Placer le Gel:Placez soigneusement le gel équilibré sur la membrane. Assurez un bon contact et retirez toutes les bulles d'air en roulant.
4
Compléter la Pile:Placez 3 papiers filtre imbibés de tampon cathode sur le gel. Retirez les bulles d'air. Fermez l'appareil de transfert.
5
Transfert:Appliquez un courant constant : 0,8-1,2 mA par cm² de surface de gel. Pour un mini-gel standard (8 x 10 cm), utilisez 15V pendant 30-60 minutes. Surveillez la température - les transferts semi-secs peuvent surchauffer. Utilisez un refroidissement si la température dépasse 30°C.

Blocage et Incubation d'Anticorps - Protocole Détaillé

Le blocage et l'incubation avec les anticorps sont des étapes critiques pour la détection spécifique de votre protéine cible. Cette section fournit des protocoles détaillés pour chaque étape.

Blocage de la Membrane - Protocole Détaillé

Le blocage empêche la liaison non spécifique des anticorps à la membrane, réduisant le bruit de fond et améliorant le rapport signal/bruit.

Blocking Solutions:

5% Lait Écrémé dans TBST (Standard) :

Dissolvez 5 g de lait écrémé en poudre dans 100 mL de TBST. Mélangez bien jusqu'à dissolution complète. Peut nécessiter une filtration à travers une étamine pour éliminer les particules non dissoutes. Préparer frais ou conserver à 4°C jusqu'à 1 semaine. Agitez bien avant utilisation.

Applications: La plupart des applications générales, rentable, fonctionne bien pour la plupart des anticorps

Limitations: Contient de la caséine qui peut interférer avec les anticorps spécifiques aux phosphates, peut causer un bruit de fond élevé pour certains anticorps

3-5% BSA dans TBST (Pour Protéines Phosphorylées) :

Dissolvez 3-5 g de BSA (albumine de sérum bovin, Fraction V) dans 100 mL de TBST. Mélangez doucement pour éviter la mousse. Filtrez à travers un filtre de 0,45 μm si nécessaire. Conservez à 4°C. Utilisez dans les 1 semaine.

Applications: Protéines phosphorylées, lorsque le lait cause un bruit de fond élevé, certains anticorps sensibles

Advantages: Aucune interférence de caséine, bruit de fond plus faible pour les anticorps phospho, plus cohérent

1
Préparer la Solution de Blocage:Préparez la solution de blocage fraîche ou utilisez une solution stockée (vérifiez l'expiration). Pour 5% de lait : Dissolvez 5 g de lait écrémé en poudre dans 100 mL de TBST. Mélangez bien en tournant ou en inversant doucement jusqu'à dissolution complète (5-10 minutes). Si des particules persistent, filtrez à travers une étamine ou un filtre de 0,45 μm. Pour BSA : Dissolvez 3-5 g de BSA dans 100 mL de TBST, mélangez doucement pour éviter la mousse. Conservez à 4°C si vous ne l'utilisez pas immédiatement.
2
Retirer la Coloration Ponceau S (Optionnel):Si vous avez vérifié le transfert avec la coloration Ponceau S, lavez brièvement la membrane avec TBST (2-3 rinçages rapides, 30 secondes chacun) pour éliminer la coloration. Cette étape est optionnelle - le Ponceau S peut être laissé car il sera éliminé lors des lavages ultérieurs. Égouttez l'excès de TBST mais ne laissez pas la membrane sécher.
3
Transférer la Membrane dans la Solution de Blocage:Placez la membrane côté protéine vers le haut dans la solution de blocage. Utilisez un volume suffisant pour couvrir complètement la membrane : mini-gel (8 x 10 cm) nécessite 10-20 mL, les membranes plus grandes peuvent nécessiter 30-50 mL. Assurez-vous que la membrane flotte librement et est complètement immergée. Retirez toute bulle d'air en tapotant doucement ou en utilisant une pince.
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Incuber avec Agitation Douce:Placez le récipient sur un rocker ou un agitateur réglé à vitesse douce (20-30 rpm). Incubez à température ambiante (20-25°C) pendant 1 heure. Pour les problèmes de bruit de fond élevé, prolongez à 2 heures ou utilisez une concentration plus élevée (10% de lait). Alternativement, le blocage peut être effectué à 4°C pendant la nuit (12-16 heures) si pratique - cela peut améliorer l'efficacité du blocage pour certaines applications.
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Procéder à l'Anticorps Primaire:Après le blocage, ne lavez pas la membrane. Égouttez l'excès de solution de blocage en touchant le bord avec une serviette en papier, mais ne laissez pas la membrane sécher. Procédez immédiatement à l'incubation avec l'anticorps primaire en utilisant le même type de solution de blocage (lait ou BSA) pour diluer l'anticorps primaire.

Tips:

Assurez-vous que la membrane est complètement immergée dans la solution de blocage - une couverture insuffisante cause un bruit de fond élevé
Utilisez une agitation ou un balancement doux (20-30 rpm) - une agitation trop vigoureuse peut endommager la membrane ou causer un blocage inégal
Le blocage peut être effectué à 4°C pendant la nuit si pratique - cela peut améliorer l'efficacité du blocage
Pour les protéines phosphorylées, utilisez toujours du BSA, pas du lait - le lait contient de la caséine qui interfère avec les anticorps spécifiques aux phosphates
Préparez la solution de blocage fraîche lorsque possible - les solutions stockées peuvent perdre de leur efficacité
Utilisez un volume adéquat - la membrane doit flotter librement, ne pas coller aux parois du récipient
Ne réutilisez pas la solution de blocage - elle peut contenir des protéines transférées ou des contaminants

Incubation d'Anticorps Primaire - Protocole Détaillé

L'anticorps primaire se lie spécifiquement à votre protéine cible. Une dilution et des conditions d'incubation appropriées sont critiques.

Dilution d'Anticorps :

Anticorps monoclonaux : Typiquement 1:1000 à 1:5000 dans la solution de blocage
Anticorps polyclonaux : Typiquement 1:500 à 1:2000 dans la solution de blocage
Commencez avec la dilution recommandée par le fabricant, puis optimisez par titrage
Diluez l'anticorps dans la solution de blocage (même solution utilisée pour le blocage)

Optimization: Si le signal est faible : Augmentez la concentration ou prolongez l'incubation. Si le bruit de fond est élevé : Diminuez la concentration ou augmentez le temps de blocage.

Conditions d'Incubation :

Pendant la Nuit à 4°C (Recommandé)

Meilleur rapport signal/bruit, détection la plus sensible. Incubez dans une chambre froide ou un réfrigérateur avec agitation ou balancement doux.

Duration: 12-16 heures

Advantages: Sensibilité plus élevée, meilleur rapport signal/bruit, timing pratique

Température Ambiante

Méthode plus rapide, adaptée lorsque la nuit n'est pas possible.

Duration: 1-2 heures avec agitation douce

Advantages: Plus rapide, pratique pour les résultats le même jour

Limitations: Peut avoir un bruit de fond légèrement plus élevé, moins sensible que la nuit

Volume: Utilisez un volume suffisant pour couvrir la membrane (typiquement 5-10 mL pour mini-gel). Peut réutiliser la solution d'anticorps 2-3 fois si stockée correctement à 4°C avec un conservateur (0,02% azoture de sodium).

1
Calculer et Préparer la Dilution d'Anticorps:Déterminez le volume requis en fonction de la taille de la membrane : mini-gel (8 x 10 cm) nécessite 5-10 mL, les membranes plus grandes nécessitent 15-20 mL. Calculez le volume d'anticorps nécessaire. Exemple : Pour une dilution 1:1000 dans 5 mL, ajoutez 5 μL d'anticorps primaire stock à 5 mL de solution de blocage. Utilisez une micropipette pour des volumes précis. Mélangez doucement en pipettant de haut en bas ou en inversant le récipient 5-10 fois. Ne pas vortexer car cela peut causer de la mousse ou de la dénaturation.
2
Transférer la Membrane dans la Solution d'Anticorps:Après le blocage, égouttez l'excès de solution de blocage (ne laissez pas la membrane sécher). Placez la membrane côté protéine vers le haut dans la solution d'anticorps primaire. Assurez-vous que la membrane est complètement couverte et immergée. Pour les petites membranes, utilisez un sac scellable (retirez les bulles d'air avant de sceller) ou un petit récipient. Pour les membranes plus grandes, utilisez un plateau ou un récipient avec suffisamment de solution pour couvrir complètement. Étiquetez le récipient avec le nom de l'anticorps, la dilution et la date.
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Incuber à la Température Choisie:Pour l'incubation pendant la nuit (recommandée) : Placez dans une chambre froide ou un réfrigérateur (4°C) avec agitation ou balancement doux (20-30 rpm) pendant 12-16 heures. Assurez-vous que le récipient est scellé pour empêcher l'évaporation. Pour l'incubation à température ambiante : Placez sur un rocker à température ambiante (20-25°C) avec agitation douce pendant 1-2 heures. Surveillez la température - évitez la surchauffe. L'incubation pendant la nuit fournit généralement un meilleur rapport signal/bruit.
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Sauvegarder la Solution d'Anticorps (Optionnel):Après l'incubation, la solution d'anticorps primaire peut être sauvegardée pour réutilisation. Ajoutez 0,02% d'azoture de sodium (ajoutez 10 μL d'azoture de sodium à 10% par 5 mL de solution) pour empêcher la croissance bactérienne. Stockez à 4°C dans un récipient scellé. Étiquetez avec le nom de l'anticorps, la dilution, la date et le nombre d'utilisations. La plupart des anticorps peuvent être réutilisés 2-3 fois, mais le signal peut diminuer à chaque utilisation. Jetez si une contamination est suspectée.
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Retirer la Membrane et Procéder au Lavage:Retirez soigneusement la membrane de la solution d'anticorps en utilisant une pince propre. Égouttez l'excès de solution en touchant le bord avec une serviette en papier. Ne laissez pas la membrane sécher. Procédez immédiatement aux étapes de lavage. Ne lavez pas la membrane avant ce point - le lavage avant l'incubation avec l'anticorps primaire n'est pas nécessaire et peut réduire le signal.

Tips:

Toujours diluer l'anticorps primaire dans la même solution de blocage utilisée pour le blocage (lait ou BSA)
Utilisez un volume adéquat - un volume insuffisant cause une liaison inégale et un bruit de fond élevé
L'incubation pendant la nuit à 4°C est recommandée pour le meilleur rapport signal/bruit
Protégez de la lumière si vous utilisez des anticorps sensibles à la lumière
Étiquetez tous les récipients clairement avec les informations sur l'anticorps
Ne laissez pas la membrane sécher à aucun moment pendant le processus
Peut réutiliser la solution d'anticorps primaire 2-3 fois si stockée correctement avec de l'azoture de sodium

Incubation d'Anticorps Secondaire - Protocole Détaillé

L'anticorps secondaire est conjugué à une molécule de détection (HRP, colorant fluorescent) et se lie à l'anticorps primaire.

L'anticorps secondaire reconnaît et se lie à l'anticorps primaire, permettant la détection grâce à son enzyme conjuguée (HRP) ou son marqueur fluorescent. Une sélection, une dilution et des conditions d'incubation appropriées sont cruciales pour un rapport signal/bruit optimal. Utilisez toujours des anticorps secondaires appariés à l'espèce (anti-lapin pour primaire lapin, anti-souris pour primaire souris) et préparez des solutions fraîches pour chaque expérience.

Sélection d'Anticorps Secondaire :

Doit être spécifique à l'espèce de votre anticorps primaire (par exemple, anti-lapin pour primaire lapin, anti-souris pour primaire souris)
Utilisez des anticorps secondaires hautement cross-adsorbés pour minimiser la réactivité croisée
Choisissez le conjugué approprié : HRP pour la chimiluminescence, colorants fluorescents (IRDye, Alexa Fluor) pour la fluorescence
Pour la détection multiplex, utilisez des anticorps secondaires avec différentes longueurs d'onde d'émission

Lignes Directrices de Dilution :

HRP-conjugated: Conjugué HRP : 1:5000 à 1:10000 dans la solution de blocage

Fluorescent: Marqué fluorescent : Suivez les recommandations du fabricant, typiquement 1:5000 à 1:15000

Optimization: Commencez avec la recommandation du fabricant, puis optimisez. Une concentration trop élevée cause un bruit de fond élevé.

Exemple de calcul : Pour une dilution 1:5000, ajoutez 1 μL d'anticorps secondaire à 5 mL de solution de blocage. Pour 1:10000, ajoutez 0,5 μL à 5 mL. Utilisez une micropipette pour des volumes précis. Mélangez doucement par inversion ou pipetage - évitez le vortexage car cela peut causer de la mousse.

Préparez la dilution dans la solution de blocage (identique à celle utilisée pour l'étape de blocage). Calculez le volume nécessaire en fonction de la taille de la membrane : mini-gel (8 x 10 cm) nécessite 5-10 mL, les membranes plus grandes peuvent nécessiter 15-20 mL. Préparez toujours frais - ne réutilisez jamais les solutions d'anticorps secondaire car elles se dégradent et causent un bruit de fond élevé.

1
Préparer la Dilution d'Anticorps Secondaire:Calculez le volume nécessaire en fonction de la taille de la membrane. Préparez la dilution dans la solution de blocage (même que celle utilisée pour le blocage). Exemple : Pour une dilution 1:5000 dans 5 mL, ajoutez 1 μL d'anticorps secondaire à 5 mL de solution de blocage. Mélangez doucement par inversion ou pipetage. Préparez toujours frais - ne réutilisez jamais les solutions d'anticorps secondaire.
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Transférer la Membrane:Après les lavages finaux de l'anticorps primaire, égouttez l'excès de TBST (ne laissez pas la membrane sécher). Placez la membrane dans la solution d'anticorps secondaire. Assurez-vous que la membrane est complètement couverte. Utilisez un volume suffisant (typiquement 5-10 mL pour mini-gel).
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Incuber:Incuber à température ambiante (20-25°C) avec agitation douce pendant 1 heure. Pour les anticorps fluorescents, protégez de la lumière pendant l'incubation. Ne prolongez pas l'incubation - cela peut augmenter le bruit de fond.
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Procéder au Lavage:Retirez la membrane et procédez immédiatement aux lavages finaux. Ne réutilisez jamais la solution d'anticorps secondaire.

Tips:

Toujours préparer frais - les solutions d'anticorps secondaire ne doivent pas être réutilisées
Utilisez la même solution de blocage que celle utilisée pour le blocage et l'anticorps primaire
Incuber à température ambiante pendant 1 heure - ne prolongez pas
Pour les anticorps fluorescents, protégez de la lumière
Utilisez un volume adéquat pour couvrir complètement la membrane
Ne prolongez pas inutilement le temps d'incubation - une incubation plus longue augmente le bruit de fond sans améliorer le signal.
Utilisez une agitation douce - une agitation trop vigoureuse peut endommager la membrane ou causer une liaison inégale.

Lavages - Protocole Détaillé

Des lavages approfondis éliminent les anticorps non liés et réduisent le signal de fond.

Des lavages appropriés sont critiques pour éliminer les anticorps primaire et secondaire non liés, ce qui réduit significativement le signal de fond et améliore le rapport signal/bruit. Les lavages doivent être approfondis mais pas excessifs, car un sur-lavage peut réduire le signal spécifique. Utilisez du TBST frais pour chaque lavage et assurez un volume adéquat pour couvrir complètement la membrane.

Matériaux Requis :

TBST (solution saline tamponnée Tris avec 0,1% Tween-20)
TBS (solution saline tamponnée Tris sans Tween-20) - optionnel pour le lavage final
Récipient ou plateau de lavage
Plateforme de balancement ou agitateur
TBST frais pour chaque lavage (typiquement 20-50 mL par lavage pour mini-gel)

Après l'Incubation d'Anticorps Primaire :

1
Premier Lavage:Retirez la membrane de la solution d'anticorps primaire en utilisant une pince propre. Égouttez l'excès de solution d'anticorps en touchant le bord avec une serviette en papier. Placez immédiatement la membrane dans du TBST frais (20-50 mL pour mini-gel). Assurez-vous que la membrane est complètement immergée. Placez sur un rocker à vitesse douce (20-30 rpm) pendant 5 minutes à température ambiante.
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Lavages Subséquents:Versez complètement le TBST utilisé. Ajoutez du TBST frais (20-50 mL). Continuez le lavage pendant 5 minutes avec agitation douce. Répétez ce processus 3-5 fois au total (4-6 lavages incluant le premier lavage). Pour la plupart des applications, 4-5 lavages de 5 minutes chacun sont suffisants.
3
Vérification du Lavage Primaire Final:Après le lavage final, égouttez brièvement l'excès de TBST. La membrane devrait être prête pour l'incubation avec l'anticorps secondaire. Ne laissez pas la membrane sécher entre les lavages ou avant l'ajout de l'anticorps secondaire.

Tips:

Utilisez toujours du TBST frais pour chaque lavage - réutiliser le tampon de lavage réduit l'efficacité
Assurez un volume adéquat - la membrane doit flotter librement, ne pas coller au récipient
Maintenez une agitation douce - une agitation trop vigoureuse peut endommager la membrane
Ne prolongez pas le temps de lavage inutilement - 5 minutes par lavage est standard

Après l'Incubation d'Anticorps Secondaire :

1
Lavages Initiaux:Retirez la membrane de la solution d'anticorps secondaire. Égouttez l'excès de solution. Placez dans du TBST frais (20-50 mL). Lavez 3-5 fois pendant 5 minutes chacune avec agitation douce, en changeant le TBST entre chaque lavage. Cela élimine l'anticorps secondaire non lié.
2
Lavages Prolongés pour Bruit de Fond Élevé:Si le bruit de fond est élevé, augmentez à 5-7 lavages de 10 minutes chacun. Alternativement, ajoutez 0,1% SDS au TBST (ajoutez 100 μL de SDS 10% à 100 mL de TBST) pour un lavage plus strict. Le SDS aide à éliminer les anticorps liés non spécifiquement.
3
Rinçage Final (Optionnel):Pour la détection chimiluminescente, effectuez un rinçage final rapide (30 secondes à 1 minute) avec TBS (sans Tween-20). Cela élimine le Tween-20 résiduel qui peut interférer avec certains substrats ECL. Égouttez l'excès de TBS avant de procéder à la détection.

Tips:

Les lavages d'anticorps secondaire sont plus critiques - l'anticorps secondaire non lié cause un bruit de fond élevé
Surveillez le bruit de fond pendant le lavage - s'il reste élevé après 5 lavages, prolongez le lavage
Pour la détection fluorescente, le rinçage final TBS n'est généralement pas nécessaire
Ne sur-lavez pas - un lavage excessif peut réduire le signal spécifique

Optimisation des Lavages :

Si le Bruit de Fond est Élevé :

Augmentez le nombre de lavages : 5-7 lavages au lieu de 3-5
Augmentez la durée du lavage : 10 minutes par lavage au lieu de 5 minutes
Ajoutez 0,1% SDS au tampon de lavage : Préparez TBST avec 0,1% SDS (ajoutez 100 μL de SDS 10% par 100 mL de TBST)
Utilisez TBS pour les lavages finaux : Remplacez TBST par TBS (sans Tween-20) pour les 2-3 derniers lavages
Augmentez le volume de lavage : Utilisez 50-100 mL par lavage au lieu de 20-50 mL
Vérifiez les concentrations d'anticorps : Un bruit de fond élevé peut indiquer que la concentration d'anticorps est trop élevée

Si le Signal Devient Faible Après le Lavage :

Réduisez le nombre de lavages : Essayez 3 lavages au lieu de 5
Réduisez la durée du lavage : Essayez 3 minutes par lavage au lieu de 5 minutes
Vérifiez la liaison d'anticorps : Un signal faible peut indiquer une mauvaise liaison d'anticorps primaire - vérifiez avec un témoin positif
Vérifiez que l'anticorps n'est pas lavé : Certains anticorps ont une liaison plus faible - réduisez la rigueur du lavage
Vérifiez les réactifs de détection : Assurez-vous que le substrat ECL ou les réactifs de détection fluorescente sont frais et fonctionnent correctement

Méthodes de Détection

La détection révèle la présence et la quantité de votre protéine cible. Cette section couvre les méthodes de détection chimiluminescente et fluorescente avec des protocoles détaillés.

Détection Chimiluminescente (ECL)

La détection chimiluminescente utilise des substrats ECL qui produisent de la lumière lorsqu'ils sont oxydés par la HRP. C'est la méthode la plus couramment utilisée pour la détection de western blot.

1
Préparer le Substrat ECL:Mélangez les composants du substrat ECL selon les instructions du fabricant. La plupart des kits ECL ont deux composants (luminol et peroxyde) qui sont mélangés 1:1 juste avant utilisation. Mélangez des volumes égaux et utilisez immédiatement.
2
Incuber la Membrane:Placez la membrane côté protéine vers le haut sur une surface propre. Pipettez le substrat ECL sur la membrane, en assurant une couverture complète. Incubez pendant 1-5 minutes à température ambiante. Une incubation plus longue (jusqu'à 5 minutes) peut augmenter le signal mais peut aussi augmenter le bruit de fond.
3
Retirer l'Excès de Substrat:Égouttez l'excès de substrat en inclinant la membrane. Ne laissez pas la membrane sécher. Enveloppez dans un film plastique ou placez dans une cassette d'imagerie. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles d'air entre la membrane et l'enveloppe.
4
Capture d'Image:Pour le film radiographique : Exposez le film pendant 1 seconde à 10 minutes selon la force du signal. Commencez avec une exposition courte (1-5 secondes) et ajustez. Développez le film selon les instructions du fabricant. Pour la caméra CCD : Placez dans le système d'imagerie et capturez l'image. Ajustez le temps d'exposition pour éviter la saturation.
5
Expositions Multiples:Prenez plusieurs expositions à différents moments pour vous assurer de capturer à la fois les bandes fortes et faibles dans la plage linéaire. Documentez le temps d'exposition pour chaque image.

Détection Fluorescente

La détection fluorescente utilise des anticorps secondaires conjugués à des colorants fluorescents. Cette méthode permet la détection multiplex et la quantification plus précise.

1
Sélection d'Anticorps Secondaire:Utilisez des anticorps secondaires marqués de manière fluorescente. Options courantes : IRDye 680/800 (LI-COR), Alexa Fluor 488/555/647, ou conjugués DyLight. Choisissez des longueurs d'onde qui ne se chevauchent pas si vous détectez plusieurs protéines.
2
Incubation:Incuber avec l'anticorps secondaire fluorescent comme décrit dans la section d'incubation d'anticorps. Protégez de la lumière pendant et après l'incubation pour empêcher le photoblanchiment.
3
Lavages:Lavez soigneusement avec TBST comme décrit. Le lavage final peut être avec TBS pour réduire la fluorescence de fond.
4
Balayage:Balaiez la membrane avec la longueur d'onde laser appropriée pour votre fluorophore. Pour IRDye : canaux 680 nm et 800 nm. Pour Alexa Fluor : utilisez la longueur d'onde d'excitation appropriée. Ajustez la puissance du laser et la résolution de balayage pour un signal optimal.
5
Analyse d'Image:Utilisez un logiciel d'imagerie pour quantifier l'intensité des bandes. La plupart des systèmes fournissent des outils de quantification intégrés. Assurez-vous que toutes les bandes sont dans la plage de détection linéaire.

Détection Colorimétrique

La détection colorimétrique utilise des substrats qui produisent un précipité coloré. Moins sensible que la chimiluminescence mais ne nécessite pas d'équipement spécialisé.

1
Préparer le Substrat:Préparez le substrat colorimétrique selon les instructions du fabricant (par exemple, DAB, BCIP/NBT).
2
Appliquer et Développer:Appliquez le substrat sur la membrane et incubez jusqu'à ce que les bandes apparaissent. Arrêtez la réaction en rinçant avec de l'eau.
3
Arrêter la Réaction:Arrêtez la réaction lorsque les bandes atteignent l'intensité désirée en lavant avec de l'eau ou une solution d'arrêt (si fournie).
4
Documenter Immédiatement:Documentez les résultats immédiatement en scannant ou en photographiant. La couleur peut s'estomper avec le temps, surtout avec certains substrats.

Quantification Western Blot

La quantification permet de mesurer la quantité relative ou absolue de votre protéine cible. Cette section couvre les méthodes de quantification et l'analyse des données.

Analyse ImageJ (Gratuit, Open Source) :

1
Ouvrez l'image dans ImageJ (Fichier > Ouvrir). Convertissez en niveaux de gris 8 bits ou 16 bits si nécessaire (Image > Type > 8 bits).
2
Dessinez un rectangle autour de la première bande en utilisant l'outil Rectangle. Allez dans Analyser > Gels > Sélectionner la Première Voie (ou utilisez Ctrl+1).
3
Déplacez le rectangle vers la bande suivante et appuyez sur '2' pour la deuxième voie. Répétez pour toutes les bandes de la voie.
4
Après avoir sélectionné toutes les bandes de la première voie, appuyez sur '3' pour passer à la voie suivante. Répétez le processus de sélection.
5
Une fois toutes les bandes sélectionnées, allez dans Analyser > Gels > Tracer les Voies. Cela crée des profils d'intensité.
6
Utilisez l'outil Bagette magique pour sélectionner les pics et mesurer l'aire sous la courbe (densité intégrée).
7
Enregistrez les valeurs pour chaque bande. Calculez les rapports et normalisez comme décrit ci-dessus.

Conseils de Quantification et Meilleures Pratiques

Assurez-vous que tous les échantillons sont dans la plage de détection linéaire - les bandes saturées ne peuvent pas être quantifiées avec précision
Utilisez le même temps d'exposition pour tous les échantillons lors de l'utilisation de la chimiluminescence - des expositions différentes rendent la comparaison invalide
Incluez plusieurs répliquats biologiques (au moins n=3) - les répliquats techniques ne sont pas suffisants
Utilisez une analyse statistique appropriée - consultez un biostatisticien si vous n'êtes pas sûr
Documentez tous les paramètres d'analyse (temps d'exposition, paramètres du logiciel, méthode de normalisation)
Validez que le contrôle de chargement est approprié pour vos conditions expérimentales
Envisagez d'utiliser la normalisation totale des protéines comme alternative ou complément au contrôle de chargement
Soyez conscient que les changements de pliage peuvent être sous-estimés si le contrôle de chargement varie entre les conditions
Pour la publication, incluez les images brutes et les données de quantification dans les matériaux supplémentaires

Guide de Dépannage Western Blot

Ce guide vous aide à identifier et résoudre les problèmes courants dans les expériences de western blot.

Aucun Signal

Primary antibody concentration too low:

Increase antibody concentration or extend incubation time

Protein not transferred to membrane:

Vérifiez l'efficacité du transfert en colorant la membrane avec Ponceau S. Optimisez les conditions de transfert.

Anticorps non spécifique pour la cible:

Vérifiez la spécificité de l'anticorps avec des témoins positifs et négatifs

Detection reagent expired or improperly stored:

Use fresh detection reagents, store according to manufacturer's instructions

Bruit de Fond Élevé

Insufficient blocking:

Increase blocking time to 2 hours or use higher concentration (10% milk)

Antibody concentration too high:

Dilute antibodies further, optimize through titration

Insufficient washing:

Augmentez le nombre et la durée des lavages, ajoutez 0,1% de SDS au tampon de lavage

Membrane contamination:

Utilisez des pinces propres, évitez de toucher la membrane avec les mains nues

Non-Specific Bands

Antibody cross-reactivity:

Use more specific antibody or pre-adsorbed secondary antibody

Protein degradation:

Utilisez des échantillons frais, ajoutez des inhibiteurs de protéase

Incomplete denaturation:

Assurez-vous que les échantillons sont chauffés à 95°C pendant 5 minutes

Incomplete Transfer

Large proteins (>100 kDa) not transferring:

Prolongez le temps de transfert à 2-3 heures, réduisez la concentration de méthanol à 10%, ajoutez 0,1% de SDS au tampon de transfert

Small proteins (<20 kDa) passing through membrane:

Réduisez le temps de transfert à 30-45 minutes, augmentez le méthanol à 25%, ou utilisez une membrane de taille de pore 0,2 μm pour les petites protéines

Uneven transfer across membrane:

Assurez-vous d'un bon contact entre le gel et la membrane, retirez toutes les bulles d'air en roulant avec un tube à essai, vérifiez que la pile de transfert est correctement assemblée, assurez-vous que le tampon est bien agité pendant le transfert

Stratégies d'Optimisation

L'optimisation systématique améliore considérablement les résultats de western blot. Cette section fournit des guides détaillés pour optimiser chaque étape du processus.

Optimisation de la Préparation des Échantillons

Une préparation appropriée des échantillons est la base d'un western blot réussi. Optimisez les conditions de lyse, la concentration protéique et la préparation des échantillons.

Sélection du Tampon de Lyse:

Tampon RIPA : Le plus courant, bon pour la plupart des protéines, contient des détergents (NP-40, désoxycholate, SDS) pour une lyse complète. Meilleur pour les protéines cytoplasmiques et nucléaires. Peut être trop agressif pour certaines protéines membranaires.
Tampon NP-40 : Plus doux, bon pour les protéines membranaires et les complexes protéiques, moins dénaturant. Préserve mieux les interactions protéine-protéine que RIPA.
Tampon Laemmli : Lyse directe, pas d'étape de lyse séparée nécessaire. Méthode la plus rapide mais peut ne pas extraire toutes les protéines efficacement.
Tampon Urée/Thiourée : Pour les protéines difficiles à solubiliser, en particulier les protéines membranaires. Nécessite un ajustement soigneux du pH.
Testez différents tampons systématiquement pour trouver le meilleur pour votre protéine

Commencez avec RIPA pour la plupart des applications. Si le signal est faible ou la protéine apparaît dégradée, testez NP-40. Pour les protéines membranaires, essayez NP-40 en premier. Pour les protéines nucléaires, vous pourriez avoir besoin de conditions plus agressives ou d'une extraction séquentielle. Pour les protéines phosphorylées, assurez-vous que les inhibiteurs de phosphatase sont inclus.

Concentration Protéique:

Chargement typique : 20-50 μg de protéine totale par puits pour la plupart des applications
Pour les protéines hautement exprimées (par exemple, actine, tubuline) : 10-20 μg sont souvent suffisants
Pour les protéines de faible abondance (par exemple, facteurs de transcription, kinases) : 50-100 μg peuvent être nécessaires
Pour les protéines de très faible abondance : Jusqu'à 150 μg, mais surveillez l'étalement et les artefacts
Trop de protéines (>100 μg) cause un étalement, une mauvaise résolution, et peut saturer la détection
Trop peu de protéines (<10 μg) peut ne pas être détectable, en particulier pour les cibles de faible abondance

Commencez avec 30 μg comme référence. Si le signal est faible, augmentez à 50-75 μg. Si les bandes sont étalées ou la résolution est mauvaise, diminuez à 20-25 μg. Pour les comparaisons quantitatives, assurez-vous que tous les échantillons ont des concentrations protéiques identiques. Utilisez le dosage BCA ou Bradford pour une quantification précise - ne pas estimer.

Ratio Tampon d'Échantillon:

Standard : 3 parties d'échantillon pour 1 partie de tampon d'échantillon 4X (concentration finale 1X)
Pour les échantillons concentrés (>10 mg/mL) : Peut nécessiter de diluer l'échantillon avant d'ajouter le tampon pour éviter la sur-concentration
Pour les échantillons dilués (<1 mg/mL) : Peut nécessiter de concentrer avant d'ajouter le tampon, ou utiliser un tampon d'échantillon 2X
Assurez-vous que la concentration finale de SDS est adéquate (0,1-0,2%) pour une dénaturation appropriée
La concentration finale de glycérol (5-10%) aide les échantillons à couler dans les puits

Si les bandes ne sont pas nettes ou les protéines apparaissent agrégées, augmentez le ratio de tampon d'échantillon ou assurez-vous d'un chauffage approprié. Si les échantillons sont trop visqueux, diluez de manière appropriée. Ajoutez toujours un agent réducteur frais (2-ME ou DTT) juste avant le chauffage.

Conditions de Chauffage:

Standard : 95°C pendant 5 minutes - fonctionne pour la plupart des protéines, assure une dénaturation complète
Alternative : 70°C pendant 10 minutes - plus doux, pour les protéines sensibles à la température qui s'agrègent à 95°C
Certaines protéines peuvent s'agréger à haute température - testez 60°C, 70°C, 80°C, 95°C pour trouver l'optimal
Pour les protéines membranaires : Parfois 37°C pendant 30 minutes fonctionne mieux que la haute température
Ne jamais sauter le chauffage - une dénaturation incomplète cause une mauvaise migration et des artefacts

Si vous voyez plusieurs bandes ou un étalement qui suggère une agrégation, testez des températures plus basses. Si les bandes ne sont pas nettes ou la migration est incohérente, assurez-vous que le chauffage est complet (vérifiez que les échantillons sont réellement à la température). Utilisez un bloc chauffant ou un bain-marie - le chauffage au micro-ondes est incohérent.

Ajout d'Inhibiteurs:

Ajoutez toujours des inhibiteurs frais juste avant utilisation - ils se dégradent avec le temps
Inhibiteurs de protéase : PMSF (1 mM), ou cocktail commercial (suivez les instructions du fabricant)
Inhibiteurs de phosphatase : NaF (10-50 mM), Na3VO4 (1-2 mM), ou cocktail commercial
Pour les protéines phosphorylées : Les inhibiteurs de phosphatase sont critiques - ajoutez au tampon de lyse immédiatement
Stockez les stocks d'inhibiteurs correctement : PMSF dans l'isopropanol, Na3VO4 dans l'eau, cocktails comme recommandé

Si vous voyez des produits de dégradation (plusieurs bandes de poids moléculaire plus faible), augmentez la concentration d'inhibiteur de protéase ou essayez différents inhibiteurs. Si le signal de phosphorylation est faible ou incohérent, assurez-vous que les inhibiteurs de phosphatase sont frais et à la concentration correcte.

Optimisation du Gel - Guide Détaillé

L'optimisation des paramètres du gel améliore la résolution et la séparation des protéines.

Une optimisation appropriée du gel assure : (1) Séparation protéique optimale basée sur le poids moléculaire, (2) Bandes nettes et bien résolues, (3) Distance de migration appropriée pour votre protéine cible, (4) Artefacts et étalement minimaux

Pourcentage de Gel:

Le pourcentage de gel détermine la taille des pores et affecte directement la migration des protéines. Le pourcentage optimal permet à votre protéine de migrer vers le tiers médian du gel de résolution pour la meilleure résolution.

Commencez avec un gel à 10% (le plus polyvalent, fonctionne pour les protéines 30-100 kDa). Pour les protéines <20 kDa, augmentez à 15-20% pour une meilleure séparation. Pour les protéines >100 kDa, diminuez à 6-8% pour permettre la migration. Testez différents pourcentages systématiquement : préparez des gels à 8%, 10%, 12%, 15% et exécutez le même échantillon pour comparer la résolution.

Protéines <20 kDa : Utilisez des gels à 15-20%. Un pourcentage plus élevé crée des pores plus petits, fournissant une meilleure séparation pour les petites protéines. Exemple : Histones, petits peptides, produits de dégradation.:

Protéines 20-100 kDa : Utilisez des gels à 10-12%. C'est la plage la plus courante. Exemple : La plupart des protéines de signalisation, facteurs de transcription, enzymes métaboliques.:

Protéines 20-100 kDa : Utilisez des gels à 10-12%. C'est la plage la plus courante. Exemple : La plupart des protéines de signalisation, facteurs de transcription, enzymes métaboliques.

Protéines >100 kDa : Utilisez des gels à 6-8%. Un pourcentage plus faible crée des pores plus grands, permettant aux grandes protéines de migrer. Exemple : Récepteurs, grands facteurs de transcription, protéines structurales.:

Si la taille de la protéine est inconnue : Commencez avec 10%, ou utilisez un gel en gradient (4-20% ou 8-16%) pour la meilleure chance de succès.:

Si la taille de la protéine est inconnue : Commencez avec 10%, ou utilisez un gel en gradient (4-20% ou 8-16%) pour la meilleure chance de succès.

Préparez des gels à 8%, 10%, 12% et 15%. Chargez des échantillons identiques sur chacun. Comparez : (1) Netteté des bandes, (2) Distance de migration (la cible devrait être dans le tiers médian du gel), (3) Séparation des autres bandes, (4) Résolution des marqueurs de poids moléculaire. Choisissez le pourcentage donnant la meilleure résolution pour votre cible.

Gels en Gradient:

Les gels en gradient fournissent des tailles de pores variables à travers le gel, offrant une meilleure résolution pour les protéines couvrant de larges plages de poids moléculaires.

Lors de la détection de plusieurs protéines de différentes tailles sur le même gelLorsque la taille de la protéine est inconnue ou peut varier (par exemple, variants d'épissage)Lors de l'optimisation d'une nouvelle protéine ciblePour les échantillons complexes avec de nombreuses protéines (par exemple, lysats de cellules entières)

Épaisseur du Gel:

L'épaisseur du gel affecte la capacité protéique, la résolution et les caractéristiques de manipulation.

Commencez avec 1,0 mm pour l'optimisation. Si la résolution est mauvaise et que vous avez un échantillon limité, essayez 0,75 mm. Si le signal est faible et que vous pouvez charger plus, essayez 1,5 mm.

1,0 mm: Épaisseur standard, bonne résolution, facile à manipuler, la plus couramment utilisée (Capacité protéique standard (20-50 μg par puits typique)) - Recommandé pour la plupart des applications, en particulier lors de l'optimisation
1,5 mm: Plus de capacité protéique, peut charger plus d'échantillon si nécessaire (Capacité protéique plus élevée (peut charger jusqu'à 100 μg si nécessaire)) - Résolution légèrement inférieure, les gels plus épais courent plus lentement - Lorsque vous devez charger de grandes quantités de protéines (cibles de faible abondance)
0,75 mm: Résolution plus élevée, course plus rapide, meilleur pour les petites protéines (Capacité protéique plus faible (10-30 μg par puits typique)) - Plus fragile, plus difficile à manipuler, nécessite un chargement soigneux - Pour les applications haute résolution, petites protéines, ou lorsque l'échantillon est limité

Conditions d'Exécution:

La tension et le temps d'exécution affectent la qualité de séparation, la netteté des bandes et les artefacts potentiels.

Commencez avec 100V tension constante comme référence. Si les bandes sont floues ou montrent un 'sourire' (migration incurvée), réduisez à 80V et exécutez plus longtemps. Si l'exécution est trop lente et les bandes sont nettes, vous pouvez augmenter à 120V mais surveillez la température de près. Pour les grandes protéines (>100 kDa), utilisez toujours une tension plus faible (60-80V) pour empêcher la surchauffe et améliorer le transfert.

Qualité de Préparation du Gel:

Une préparation appropriée du gel est essentielle pour une résolution optimale. Des erreurs dans la préparation peuvent causer des artefacts et une mauvaise résolution.

Problèmes Courants du Gel et Solutions :

Les bandes sont floues ou étalées:

Causes: Gel qui migre trop rapidement, Surcharge, Polymérisation incomplète, Température trop élevée

Solutions: Réduisez la tension, diminuez la charge protéique, assurez-vous d'une polymérisation complète, utilisez un refroidissement

Les bandes migrent de manière inégale (effet sourire):

Causes: Gel pas de niveau, Niveaux de tampon inégaux, Gradient de température, Variation d'épaisseur du gel

Solutions: Nivelez l'appareil de gel, assurez-vous de niveaux de tampon uniformes, maintenez une température constante, vérifiez l'épaisseur du gel

Poor resolution:

Causes: Wrong gel percentage, Incomplete polymerization, Running too fast, Gel too old

Solutions: Test different gel percentages, ensure complete polymerization, reduce voltage, use fresh gel

Optimisation du Transfert - Guide Détaillé