Buffer de lisis RIPA

Buffer de ensayo de radioinmunoprecipitación - buffer de lisis más común, bueno para la mayoría de las proteínas. Contiene detergentes (NP-40, desoxicólato, SDS).

Components

• 50 mM Tris-HCl, pH 7.4
• 150 mM NaCl
• 1% NP-40 (o IGEPAL CA-630)
• 0.5% Desoxicólato de sodio
• 0.1% SDS
• Añadir fresco antes del uso: 1 mM PMSF, inhibidores de proteasas, inhibidores de fosfatasas

Preparation

Disuelve componentes en agua desionizada, ajusta pH a 7.4, filtra y esteriliza, almacena a 4°C. Añade inhibidores justo antes del uso. Volumen final: 1 L.

Buffer de muestra Laemmli (2X)

Buffer de muestra estándar para electroforesis SDS-PAGE. Desnaturaliza proteínas y les da carga negativa.

Components

• 125 mM Tris-HCl, pH 6.8
• 4% SDS
• 20% Glicerol
• 0.004% Azul de bromofenol
• 10% 2-mercaptoetanol (añadir fresco, o usar 100 mM DTT)

Preparation

Mezcla componentes (excepto agente reductor), almacena a temperatura ambiente. Añade agente reductor (2-ME o DTT) justo antes del uso.

Buffer de transferencia húmeda

Para transferir proteínas del gel a membrana PVDF o de nitrocelulosa. La concentración de metanol se ajusta según el tipo de membrana y tamaño de proteínas.

Components

• 25 mM Tris base
• 192 mM Glicina
• 20% Metanol (para membranas PVDF)
• 0.1% SDS (opcional, para proteínas grandes >100 kDa)

Preparation

Disuelve 3.03 g de Tris base y 14.4 g de glicina en 800 mL de agua. Añade 200 mL de metanol (20% final). Ajusta a 1 L con agua. El pH generalmente no requiere ajuste (aproximadamente 8.3).

TBST (Solución salina tamponada con Tris y Tween-20)

Buffer estándar de lavado y bloqueo para western blot.

Components

• 20 mM Tris-HCl, pH 7.6
• 150 mM NaCl
• 0.1% Tween-20

Preparation

Disuelve 8.8 g de NaCl, 0.2 g de KCl, 3 g de Tris base en 800 mL de agua. Añade 0.5 mL de Tween-20 (0.05%). Ajusta pH a 7.4 con HCl. Ajusta a 1 L con agua.

5% Leche desnatada en TBST

Solución de bloqueo estándar para la mayoría de las aplicaciones de western blot

Preparation

Disuelve 5 g de leche en polvo desnatada en 100 mL de TBST. Mezcla bien, puede necesitar filtrar a través de estopilla para eliminar partículas no disueltas. Prepara fresco o almacena a 4°C hasta 1 semana. Agita bien antes del uso.

3-5% BSA en TBST

Solución de bloqueo para proteínas fosforiladas o cuando la leche causa alto fondo

Preparation

Disuelve 3-5 g de BSA (albúmina de suero bovino, Fracción V) en 100 mL de TBST. Mezcla suavemente para evitar espuma. Filtra a través de filtro de 0.45 μm si es necesario. Almacena a 4°C. Usa dentro de 1 semana.

Solución de tinción Ponceau S

Para visualizar transferencia de proteínas en la membrana

Components

• 0.1% Ponceau S
• 5% Ácido acético

Preparation

Disuelve 0.1 g de Ponceau S en 100 mL de ácido acético al 5%. Filtra antes del uso. Almacena a temperatura ambiente. Tiñe la membrana durante 2-5 minutos, enjuaga con agua para visualizar bandas.