Western Blot Hub

View Detailed Cell Lysate Preparation Protocol →

La preparación apropiada de muestras es crucial para el western blot exitoso. Esta sección cubre métodos detallados para preparar muestras de diferentes fuentes con instrucciones paso a paso.

Preparación de lisado celular

Protocolo detallado para preparar lisados de proteínas de células cultivadas. Las condiciones de lisis apropiadas son esenciales para mantener la integridad de proteínas y prevenir degradación.

1
Remueve el medio de cultivo y lava las células 2-3 veces con PBS frío (solución salina tamponada con fosfato). Asegura que todo el PBS se remueva completamente para evitar dilución del buffer de lisis. Para células adherentes, añade PBS directamente al plato. Para células en suspensión, precipita células por centrifugación a 500-1000 × g durante 5 minutos.
2
Prepara buffer de lisis fresco o usa buffer alicuotado almacenado a -20°C. Añade inhibidores de proteasas (ej: PMSF a 1 mM concentración final, o cóctel comercial de inhibidor de proteasas) e inhibidores de fosfatasas (ej: NaF a 10 mM, Na3VO4 a 1 mM) justo antes del uso. Mantén el buffer frío durante todo el proceso.
3
Añade volumen apropiado de buffer de lisis (típicamente 100-200 μL por 10^6 células o 100-150 μL por cm² de plato de cultivo). Para células adherentes, raspa las células directamente en el buffer de lisis usando un raspador de células. Para células en suspensión, resuspende el precipitado en buffer de lisis. Transfiere a un tubo de microcentrífuga pre-enfriado.
4
Incuba en hielo durante 20-30 minutos con vórtex suave ocasional cada 5-10 minutos. Para células difíciles de lisar, puedes extender la incubación a 45 minutos o realizar sonicación (3-5 pulsos de 10 segundos cada uno en hielo).
5
Centrifuga a 12,000-14,000 × g durante 15 minutos a 4°C. Esto remueve desechos celulares, núcleos y material insoluble. Para algunas aplicaciones, puedes necesitar centrifugar a velocidades más altas (20,000 × g) o realizar centrifugaciones secuenciales.
6
Recoge cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el precipitado. Transfiere a un nuevo tubo pre-enfriado. Evita recolectar cualquier material del precipitado ya que puede contener agregados insolubles que pueden interferir con la electroforesis.
7
Determina la concentración de proteínas usando ensayo BCA, Bradford o Lowry. Siempre prepara una curva estándar usando estándares BSA. Diluye muestras si es necesario para caer dentro del rango lineal del ensayo. Las concentraciones típicas oscilan entre 1-10 mg/mL para lisados celulares.

Tips:

Trabaja rápidamente y mantén todo en hielo para prevenir degradación de proteínas
Usa inhibidores de proteasas frescos ya que se degradan con el tiempo
Para proteínas fosforiladas, los inhibidores de fosfatasas son esenciales
Evita vórtex excesivo que puede causar espuma y desnaturalización de proteínas
Almacena lisados a -80°C si no se usan inmediatamente

Preparación de muestras de tejido

Protocolo para preparar extractos de proteínas de muestras de tejido. La homogeneización de tejidos requiere métodos más vigorosos que la lisis celular.

1
Recolecta tejido fresco e inmediatamente colócalo en hielo o congélalo rápidamente en nitrógeno líquido. Para tejidos congelados, mantén congelado hasta estar listo para procesar. Corta el tejido en piezas pequeñas (2-3 mm³) usando un escalpelo o hoja de afeitar en una superficie enfriada.
2
Homogeneiza el tejido en buffer de lisis frío (típicamente 10-20 volúmenes de buffer por peso de tejido, ej: 100 mg de tejido en 1-2 mL de buffer). Usa un homogeneizador mecánico, mortero y mano, o sistema de perlas. Para tejidos duros, realiza homogeneización en múltiples ráfagas cortas (10-15 segundos cada una) con intervalos de enfriamiento.
3
Incuba el homogeneizado en hielo durante 30 minutos con vórtex ocasional. Para tejidos fibrosos, extiende la incubación a 45-60 minutos. Algunos tejidos pueden beneficiarse de sonicación breve (3-5 pulsos de 5 segundos cada uno en hielo).
4
Centrifuga a 12,000-14,000 × g durante 20 minutos a 4°C. Para tejidos con alto contenido de lípidos, puedes necesitar centrifugar a velocidades más altas o realizar un paso de centrifugación adicional.
5
Si el sobrenadante contiene desechos visibles o está turbio, filtra a través de un filtro de jeringa de 0.45 μm o centrifuga nuevamente. Algunos protocolos recomiendan filtrar a través de estopilla o malla fina.
6
Determina la concentración de proteínas. Los extractos de tejido típicamente tienen concentraciones de proteínas más altas (5-20 mg/mL) que los lisados celulares. Diluye según sea necesario para el ensayo de cuantificación.

Tips:

Mantén el tejido congelado hasta el procesamiento para prevenir degradación de proteínas
Usa método de homogeneización apropiado para el tipo de tejido
Algunos tejidos pueden requerir pasos adicionales para remover lípidos o tejido conectivo
Almacena extractos a -80°C en alícuotas para evitar ciclos de congelación-descongelación

View Detailed Tissue Preparation Protocol →

Cuantificación de proteínas

La cuantificación precisa de proteínas es esencial para cargar cantidades iguales de proteína. Usa ensayo BCA, Bradford o Lowry según las instrucciones del fabricante. Siempre prepara una curva estándar para cuantificación precisa.

Electroforesis SDS-PAGE

SDS-PAGE separa proteínas basándose en peso molecular. La preparación apropiada del gel y las condiciones de ejecución son críticas para la resolución. Esta sección proporciona instrucciones detalladas paso a paso para preparar y ejecutar geles SDS-PAGE.

Materiales requeridos:

View Running Conditions Guide →

30% Acrylamide/Bis solution (29:1 or 37.5:1 ratio)
1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 (for resolving gel)
0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 (for stacking gel)
10% SDS (sodium dodecyl sulfate)
10% APS (ammonium persulfate) - prepare fresh
TEMED (N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine)
Deionized water
Gel casting system (glass plates, spacers, combs)
Isopropanol or water-saturated butanol (for overlay)

Preparación de gel de resolución (ejemplo 10%):

1
Calcular volúmenes:Para un gel de resolución al 10% (10 mL total): Mezcla 3.3 mL acrilamida al 30%, 2.5 mL Tris-HCl 1.5 M pH 8.8, 0.1 mL SDS al 10%, 4.05 mL agua desionizada. Desgasifica bajo vacío durante 10-15 minutos para remover oxígeno disuelto.
2
Añadir agentes de polimerización:Añade 50 μL APS al 10% y 10 μL TEMED. Mezcla suavemente girando (no agites en vórtex ya que esto introduce burbujas). Vierte inmediatamente en el casete de gel hasta aproximadamente 1 cm por debajo de donde se sentará el peine.
3
Recubrimiento:Recubre cuidadosamente con isopropanol o butanol saturado con agua para prevenir contacto con oxígeno y crear una superficie de gel plana. Permite polimerizar durante 30-45 minutos a temperatura ambiente. Verás una interfaz clara cuando la polimerización esté completa.
4
Remover recubrimiento:Vierte el recubrimiento y enjuaga la parte superior del gel con agua desionizada. Seca la superficie superior con papel de filtro, teniendo cuidado de no tocar el gel.

Pautas de porcentaje de gel:

6-8%: Para proteínas >100 kDa (proteínas grandes)
10%: Para proteínas 30-100 kDa (más común, versátil)
12%: Para proteínas 15-60 kDa
15%: Para proteínas 10-40 kDa
18-20%: Para proteínas <20 kDa (proteínas pequeñas)

Preparación de gel de apilamiento (5%):

1
Preparar solución de gel de apilamiento:Para gel de apilamiento al 5% (4 mL total): Mezcla 0.67 mL acrilamida al 30%, 1.0 mL Tris-HCl 0.5 M pH 6.8, 0.04 mL SDS al 10%, 2.25 mL agua desionizada. Desgasifica si el tiempo lo permite.
2
Añadir agentes de polimerización:Añade 25 μL APS al 10% y 5 μL TEMED. Mezcla suavemente y vierte inmediatamente sobre el gel de resolución.
3
Insertar peine:Inserta rápidamente el peine en ángulo para evitar burbujas, luego endereza. Permite polimerizar durante 20-30 minutos. El gel debe estar listo cuando puedas ver una línea clara en los dientes del peine.
4
Remover peine:Remueve cuidadosamente el peine y enjuaga los pocillos con buffer de ejecución o agua desionizada para remover acrilamida no polimerizada. El gel ahora está listo para cargar muestras.

Carga de muestras:

1
Prepara muestras en buffer de muestra Laemmli (concentración final 1X) con 20-50 μg de proteína por pocillo. Para proteínas altamente expresadas, usa 10-20 μg. Para proteínas de baja abundancia, puedes necesitar 50-100 μg.
2
Incluye marcadores de peso molecular en al menos un pocillo. Los marcadores pre-teñidos te permiten monitorear el progreso durante la electroforesis.
3
Carga las muestras cuidadosamente usando una pipeta, evitando burbujas. Carga lentamente para evitar que las muestras se derramen en pocillos adyacentes.
4
Llena cualquier pocillo vacío con buffer de muestra 1X para asegurar distribución uniforme de corriente.

Consejos para mejor resolución

Usa APS y TEMED frescos para polimerización de gel - reactivos viejos pueden no funcionar apropiadamente
Asegura polimerización completa - polimerización incompleta causa resolución deficiente
Usa voltaje apropiado - voltaje demasiado alto causa calentamiento y artefactos
Enfría el gel durante la ejecución - especialmente cuando ejecutas a alto voltaje
Usa buffer de ejecución fresco - buffer viejo puede tener pH incorrecto

Métodos de transferencia de proteínas

La transferencia de proteínas del gel a la membrana es un paso crítico que determina la sensibilidad de detección. Esta sección proporciona protocolos detallados para diferentes métodos de transferencia.

Membrana PVDF (recomendada):

1
Corta la membrana al tamaño (ligeramente más grande que el gel)
2
Activa la membrana sumergiéndola en metanol 100% durante 30 segundos
3
Transfiere al buffer de transferencia y equilibra durante 5 minutos
4
Las membranas PVDF tienen mejor capacidad de unión de proteínas y durabilidad que la nitrocelulosa

Transferencia húmeda - Protocolo detallado

El método más comúnmente usado, proporciona excelente eficiencia de transferencia para proteínas de todos los tamaños. Óptimo para proteínas grandes (>100 kDa).

Materiales requeridos:

Tanque de transferencia húmeda
Buffer de transferencia (25 mM Tris, 192 mM glicina, 20% metanol)
Membrana PVDF o de nitrocelulosa
Papeles de filtro (3-4 por lado)
Esponjas de transferencia
Sistema de enfriamiento (hielo o cuarto frío)

1
Equilibración del gel:Después de la electroforesis, remueve cuidadosamente el gel de las placas. Equilibra el gel en buffer de transferencia durante 15-30 minutos. Esto remueve SDS excesivo y mejora la eficiencia de transferencia. Agita suavemente durante la equilibración.
2
Preparación de membrana:Para PVDF: Corta al tamaño, activa en metanol 100% durante 30 segundos, luego equilibra en buffer de transferencia durante 5 minutos. Para nitrocelulosa: Corta al tamaño y humedece directamente en buffer de transferencia durante 5 minutos.
3
Montaje del stack de transferencia:Monta el stack de transferencia en una bandeja llena de buffer de transferencia. De cátodo (negro, negativo) a ánodo (rojo, positivo): (1) Esponja, (2) 3 papeles de filtro, (3) Gel (cara hacia abajo), (4) Membrana (sobre el gel), (5) 3 papeles de filtro, (6) Esponja. Elimina TODAS las burbujas de aire rodando con un tubo de ensayo o usando un rodillo. Las burbujas de aire previenen la transferencia de proteínas en esa ubicación.
4
Condiciones de transferencia:Coloca el casete en el tanque de transferencia lleno de buffer de transferencia frío. Asegura que el buffer cubra el casete. Para transferencias estándar: 100V durante 1 hora a 4°C (con hielo o sistema de enfriamiento). Para proteínas grandes: 70-80V durante 2-3 horas. Para durante la noche: 30V durante la noche a 4°C. Asegura que el buffer esté frío y bien agitado durante la transferencia.
5
Verificación de transferencia:Después de la transferencia, verifica la eficiencia tiñendo la membrana con Ponceau S (0.1% en ácido acético al 5%) durante 2-5 minutos. Enjuaga con agua para visualizar bandas de proteínas. Esto confirma transferencia exitosa antes de proceder al bloqueo. Ponceau S puede lavarse con TBST antes del bloqueo.

Transferencia semi-seca - Protocolo detallado

Método más rápido (30-60 minutos), usa menos buffer. Adecuado para proteínas pequeñas a medianas (<100 kDa). Menos confiable para proteínas grandes.

1
Preparación de buffers:Prepara buffer ánodo: 0.3 M Tris, 20% metanol, pH 10.4. Prepara buffer cátodo: 25 mM Tris, 40 mM glicina, 10% metanol, 0.01% SDS, pH 9.4. Remoja 3 papeles de filtro en cada buffer.
2
Montaje del stack en ánodo:En placa ánodo: Coloca 3 papeles de filtro remojados en buffer ánodo. Coloca membrana PVDF activada encima (o nitrocelulosa humedecida). Elimina burbujas de aire rodando.
3
Colocar gel:Coloca cuidadosamente el gel equilibrado encima de la membrana. Asegura buen contacto y elimina todas las burbujas de aire rodando.
4
Completar stack:Coloca 3 papeles de filtro remojados en buffer cátodo encima del gel. Elimina burbujas. Cierra el aparato de transferencia.
5
Transferir:Aplica corriente constante: 0.8-1.2 mA por cm² de área de gel. Para un mini-gel estándar (8 x 10 cm), usa 15V durante 30-60 minutos. Monitorea la temperatura - las transferencias semi-secas pueden sobrecalentarse. Usa enfriamiento si la temperatura excede 30°C.

Blocking and Antibody Incubation

Proper blocking and antibody conditions are essential for specific detection with low background. This section provides detailed protocols for each step.

Blocking - Detailed Protocol

Blocking prevents non-specific binding of antibodies to the membrane, reducing background signal.

Blocking Solutions:

5% Leche desnatada en TBST (Estándar):

Disuelve 5 g de leche en polvo desnatada en 100 mL de TBST. Mezcla bien hasta disolver. Puede necesitar filtrar a través de estopilla para eliminar partículas no disueltas. Prepara fresco o almacena a 4°C hasta 1 semana. Agita bien antes del uso.

Applications: La mayoría de aplicaciones generales, rentable, funciona bien para la mayoría de anticuerpos

Limitations: Contiene caseína que puede interferir con anticuerpos fosfo-específicos, puede causar alto fondo para algunos anticuerpos

3-5% BSA en TBST (Para proteínas fosforiladas):

Disuelve 3-5 g de BSA (albúmina de suero bovino, Fracción V) en 100 mL de TBST. Mezcla suavemente para evitar espuma. Filtra a través de filtro de 0.45 μm si es necesario. Almacena a 4°C. Usa dentro de 1 semana.

Applications: Proteínas fosforiladas, cuando la leche causa alto fondo, algunos anticuerpos sensibles

Advantages: Sin interferencia de caseína, fondo más bajo para anticuerpos fosfo, más consistente

1
Preparar solución de bloqueo:Prepara solución de bloqueo fresca o usa solución almacenada (verifica expiración). Para 5% leche: Disuelve 5 g de leche en polvo desnatada en 100 mL de TBST. Mezcla bien girando o invirtiendo suavemente hasta disolver completamente (5-10 minutos). Si quedan partículas, filtra a través de estopilla o filtro de 0.45 μm. Para BSA: Disuelve 3-5 g de BSA en 100 mL de TBST, mezcla suavemente para evitar espuma. Almacena a 4°C si no usas inmediatamente.
2
Remover tinción Ponceau S (Opcional):Si verificaste la transferencia con tinción Ponceau S, lava la membrana brevemente con TBST (2-3 enjuagues rápidos, 30 segundos cada uno) para remover la tinción. Este paso es opcional - Ponceau S puede dejarse ya que se removerá durante los lavados subsecuentes. Drena el exceso de TBST pero no dejes que la membrana se seque.
3
Transferir membrana a solución de bloqueo:Coloca la membrana con la cara de proteínas hacia arriba en solución de bloqueo. Usa volumen suficiente para cubrir completamente la membrana: mini-gel (8 x 10 cm) requiere 10-20 mL, membranas más grandes pueden necesitar 30-50 mL. Asegura que la membrana flote libremente y esté completamente sumergida. Elimina cualquier burbuja de aire tocando suavemente o usando pinzas.
4
Incubar con agitación suave:Coloca el contenedor en un balanceador o agitador ajustado a velocidad suave (20-30 rpm). Incuba a temperatura ambiente (20-25°C) durante 1 hora. Para problemas de alto fondo, extiende a 2 horas o usa concentración más alta (10% leche). Alternativamente, el bloqueo puede hacerse a 4°C durante la noche (12-16 horas) si es conveniente - esto puede mejorar la eficiencia de bloqueo para algunas aplicaciones.
5
Proceder a anticuerpo primario:Después del bloqueo, no laves la membrana. Drena el exceso de solución de bloqueo tocando el borde con papel toalla, pero no dejes que la membrana se seque. Procede inmediatamente a la incubación con anticuerpo primario usando el mismo tipo de solución de bloqueo (leche o BSA) para diluir el anticuerpo primario.

Tips:

Asegura que la membrana esté completamente sumergida en solución de bloqueo - cobertura insuficiente causa alto fondo
Usa agitación o balanceo suave (20-30 rpm) - agitación demasiado vigorosa puede dañar la membrana o causar bloqueo desigual
El bloqueo puede hacerse a 4°C durante la noche si es conveniente - esto puede mejorar la eficiencia de bloqueo
Para proteínas fosforiladas, siempre usa BSA, no leche - la leche contiene caseína que interfiere con anticuerpos fosfo-específicos
Prepara solución de bloqueo fresca cuando sea posible - las soluciones almacenadas pueden perder efectividad
Usa volumen adecuado - la membrana debe flotar libremente, no pegarse a las paredes del contenedor
No reutilices solución de bloqueo - puede contener proteínas transferidas o contaminantes

Incubación con anticuerpo primario - Protocolo detallado

El anticuerpo primario se une específicamente a tu proteína objetivo. La dilución y condiciones de incubación apropiadas son críticas.

Dilución de anticuerpo:

Anticuerpos monoclonales: Típicamente 1:1000 a 1:5000 en solución de bloqueo
Anticuerpos policlonales: Típicamente 1:500 a 1:2000 en solución de bloqueo
Comienza con la dilución recomendada por el fabricante, luego optimiza mediante titulación
Diluye el anticuerpo en solución de bloqueo (la misma solución usada para bloqueo)

Optimization: Si la señal es débil: Aumenta la concentración o extiende la incubación. Si el fondo es alto: Disminuye la concentración o aumenta el tiempo de bloqueo.

Condiciones de incubación:

Durante la noche a 4°C (Recomendado)

Mejor relación señal-ruido, detección más sensible. Incuba en cuarto frío o refrigerador con agitación suave o balanceo.

Duration: 12-16 horas

Advantages: Mayor sensibilidad, mejor relación señal-ruido, tiempo conveniente

Temperatura ambiente

Método más rápido, adecuado cuando no es posible durante la noche.

Duration: 1-2 horas con agitación suave

Advantages: Más rápido, conveniente para resultados el mismo día

Limitations: Puede tener fondo ligeramente más alto, menos sensible que durante la noche

Volume: Usa volumen suficiente para cubrir la membrana (típicamente 5-10 mL para mini-gel). Puedes reutilizar la solución de anticuerpo 2-3 veces si se almacena apropiadamente a 4°C con conservante (0.02% azida sódica).

1
Calcular y preparar dilución de anticuerpo:Determina el volumen requerido basado en el tamaño de la membrana: mini-gel (8 x 10 cm) requiere 5-10 mL, membranas más grandes necesitan 15-20 mL. Calcula el volumen de anticuerpo necesario. Ejemplo: Para dilución 1:1000 en 5 mL, añade 5 μL de anticuerpo primario stock a 5 mL de solución de bloqueo. Usa una micropipeta para volúmenes precisos. Mezcla suavemente por pipeteo o invirtiendo el contenedor 5-10 veces. No agites en vórtex ya que puede causar espuma o desnaturalización.
2
Transferir membrana a solución de anticuerpo:Después del bloqueo, drena el exceso de solución de bloqueo (no dejes que la membrana se seque). Coloca la membrana con la cara de proteínas hacia arriba en la solución de anticuerpo primario. Asegura que la membrana esté completamente cubierta y sumergida. Para membranas pequeñas, usa una bolsa sellable (elimina burbujas de aire antes de sellar) o contenedor pequeño. Para membranas más grandes, usa una bandeja o contenedor con suficiente solución para cubrir completamente. Etiqueta el contenedor con nombre del anticuerpo, dilución y fecha.
3
Incubar a temperatura elegida:Para incubación durante la noche (recomendado): Coloca en cuarto frío o refrigerador (4°C) con agitación suave o balanceo (20-30 rpm) durante 12-16 horas. Asegura que el contenedor esté sellado para prevenir evaporación. Para incubación a temperatura ambiente: Coloca en balanceador a temperatura ambiente (20-25°C) con agitación suave durante 1-2 horas. Monitorea la temperatura - evita sobrecalentamiento. La incubación durante la noche generalmente proporciona mejor relación señal-ruido.
4
Guardar solución de anticuerpo (opcional):Después de la incubación, la solución de anticuerpo primario puede guardarse para reutilización. Añade 0.02% azida sódica (añade 10 μL de azida sódica al 10% por 5 mL de solución) para prevenir crecimiento bacteriano. Almacena a 4°C en un contenedor sellado. Etiqueta con nombre del anticuerpo, dilución, fecha y número de usos. La mayoría de los anticuerpos pueden reutilizarse 2-3 veces, pero la señal puede disminuir con cada uso. Descarta si se sospecha contaminación.
5
Remover membrana y proceder al lavado:Después de la incubación, remueve cuidadosamente la membrana de la solución de anticuerpo usando pinzas limpias. Drena el exceso de solución tocando el borde con papel toalla. No dejes que la membrana se seque. Procede inmediatamente a los pasos de lavado. No laves la membrana antes de este punto - el lavado antes de la incubación con anticuerpo primario no es necesario y puede reducir la señal.

Tips:

Siempre diluye el anticuerpo primario en la misma solución de bloqueo usada para bloqueo (leche o BSA)
Usa volumen adecuado - volumen insuficiente causa unión desigual y alto fondo
La incubación durante la noche a 4°C se recomienda para mejor relación señal-ruido
Protege de la luz si usas anticuerpos sensibles a la luz
Etiqueta todos los contenedores claramente con información del anticuerpo
No dejes que la membrana se seque en ningún punto durante el proceso
Puedes reutilizar la solución de anticuerpo primario 2-3 veces si se almacena apropiadamente con azida sódica

Incubación con anticuerpo secundario - Protocolo detallado

El anticuerpo secundario está conjugado con moléculas de detección (HRP, fluoróforos) y se une al anticuerpo primario.

El anticuerpo secundario reconoce y se une al anticuerpo primario, permitiendo la detección a través de la enzima unida (HRP) o etiqueta fluorescente. La selección, dilución y condiciones de incubación apropiadas son importantes para la mejor relación señal-ruido. Siempre usa anticuerpos secundarios específicos de especie (anti-conejo para primario de conejo, anti-ratón para primario de ratón) y prepara soluciones frescas para cada experimento.

Selección de anticuerpo secundario:

Debe ser específico para la especie del anticuerpo primario (ej: anti-conejo para primario de conejo, anti-ratón para primario de ratón)
Usa anticuerpos secundarios altamente cruzados-adsorbidos para minimizar reactividad cruzada
Selecciona el conjugado apropiado: HRP para quimioluminiscencia, fluoróforos (IRDye, Alexa Fluor) para fluorescencia
Para detección múltiple, usa anticuerpos secundarios con diferentes longitudes de onda de emisión

Guías de dilución:

HRP-conjugated: Conjugado con HRP: 1:5000 a 1:10000 en solución de bloqueo

Fluorescent: Etiquetado fluorescente: Sigue las recomendaciones del fabricante. Típicamente, 1:5000 a 1:15000

Optimization: Comienza con la recomendación del fabricante, luego optimiza. Concentración demasiado alta causa alto fondo.

Ejemplo de cálculo: Para dilución 1:5000 en 5 mL, añade 1 μL de anticuerpo secundario a 5 mL de solución de bloqueo. Para 1:10000, añade 0.5 μL a 5 mL. Usa una micropipeta para volúmenes precisos. Mezcla suavemente por inversión o pipeteo - evita vórtex ya que puede causar espuma.

Prepara la dilución en solución de bloqueo (la misma usada en el paso de bloqueo). Calcula el volumen requerido basado en el tamaño de la membrana: mini-gel (8 x 10 cm) requiere 5-10 mL, membranas más grandes necesitan 15-20 mL. Siempre prepara fresco - las soluciones de anticuerpo secundario se degradan y causan alto fondo, no reutilices.

1
Preparar solución de anticuerpo secundario:Calcula el volumen requerido (5-10 mL para mini-gel). Añade el volumen apropiado de solución de bloqueo a un contenedor limpio. Usando una micropipeta, añade el volumen calculado de anticuerpo secundario stock. Para dilución 1:5000 en 5 mL: añade 1 μL de anticuerpo. Mezcla suavemente por pipeteo o invirtiendo el contenedor 5-10 veces. No agites en vórtex. Etiqueta el contenedor con nombre del anticuerpo, dilución y fecha.
2
Transferir membrana a solución de anticuerpo:Después de lavar el anticuerpo primario, drena brevemente el exceso de TBST de la membrana (no dejes que se seque). Coloca la membrana con la cara de proteínas hacia arriba en la solución de anticuerpo secundario. Asegura que la membrana esté completamente sumergida. Para membranas pequeñas, usa una bolsa sellable o contenedor. Para membranas más grandes, usa una bandeja o contenedor con suficiente solución para cubrir completamente. Elimina cualquier burbuja de aire tocando suavemente o usando pinzas.
3
Incubar con agitación suave:Coloca el contenedor en un balanceador o agitador ajustado a velocidad suave (20-30 rpm). Incuba a temperatura ambiente (20-25°C) durante 1 hora. Si usas anticuerpos fluorescentes, envuelve el contenedor en papel de aluminio o colócalo en una caja oscura para proteger de la luz. Monitorea la temperatura - evita sobrecalentamiento que puede aumentar el fondo. No extiendas la incubación más allá de 1.5 horas ya que esto aumenta el fondo sin mejorar la señal.
4
Remover membrana y proceder al lavado:Después de la incubación, remueve cuidadosamente la membrana de la solución de anticuerpo usando pinzas limpias. Drena el exceso de solución tocando el borde con papel toalla. No dejes que la membrana se seque. Procede inmediatamente a los pasos de lavado. Descarta la solución de anticuerpo secundario - no reutilices ya que se degrada y causa alto fondo en usos subsecuentes.

Tips:

Siempre prepara el anticuerpo secundario fresco - no reutilices soluciones
Protege los anticuerpos fluorescentes de la luz durante y después de la incubación
Usa anticuerpos secundarios específicos de especie para evitar reactividad cruzada
Incuba a temperatura ambiente - la incubación a 4°C no es necesaria y puede reducir la señal
Asegura cobertura completa - solución insuficiente causa tinción desigual
No extiendas el tiempo de incubación innecesariamente - incubación más larga aumenta el fondo sin mejorar la señal
Usa agitación suave - agitación demasiado vigorosa puede dañar la membrana o causar unión desigual

Washing - Detailed Protocol

Thorough washing removes unbound antibodies and reduces background signal.

Proper washing is critical for removing unbound primary and secondary antibodies, which significantly reduces background signal and improves signal-to-noise ratio. Washing should be thorough but not excessive, as over-washing can reduce specific signal. Use fresh TBST for each wash and ensure adequate volume to completely cover the membrane.

Materiales requeridos:

TBST (Tris-buffered saline with 0.1% Tween-20)
TBS (Tris-buffered saline without Tween-20) - optional for final wash
Washing container or tray
Rocking platform or shaker
Fresh TBST for each wash (typically 20-50 mL per wash for mini-gel)

Después de incubación con anticuerpo primario:

1
Primer lavado:Remueve la membrana de la solución de anticuerpo primario usando pinzas limpias. Drena el exceso de solución de anticuerpo tocando el borde con papel toalla. Inmediatamente coloca la membrana en TBST fresco (20-50 mL para mini-gel). Asegura que la membrana esté completamente sumergida. Coloca en balanceador a velocidad suave (20-30 rpm) durante 5 minutos a temperatura ambiente.
2
Lavados subsecuentes:Vierte completamente el TBST usado. Añade TBST fresco (20-50 mL). Continúa lavando durante 5 minutos con agitación suave. Repite este proceso 3-5 veces en total (4-6 lavados incluyendo el primer lavado). Para la mayoría de las aplicaciones, 4-5 lavados de 5 minutos cada uno es suficiente.
3
Verificación de lavado primario final:Después del lavado final, drena brevemente el exceso de TBST. La membrana debe estar lista para la incubación con anticuerpo secundario. No dejes que la membrana se seque entre lavados o antes de la adición de anticuerpo secundario.

Tips:

Siempre usa TBST fresco para cada lavado - reutilizar buffer de lavado reduce efectividad
Asegura volumen adecuado - la membrana debe flotar libremente, no pegarse al contenedor
Mantén agitación suave - agitación demasiado vigorosa puede dañar la membrana
No extiendas el tiempo de lavado innecesariamente - 5 minutos por lavado es estándar

Después de incubación con anticuerpo secundario:

1
Lavados iniciales:Remueve la membrana de la solución de anticuerpo secundario. Drena el exceso de solución. Coloca en TBST fresco (20-50 mL). Lava 3-5 veces durante 5 minutos cada una con agitación suave, cambiando TBST entre cada lavado. Esto elimina el anticuerpo secundario no unido.
2
Lavados extendidos para alto fondo:Si el fondo es alto, aumenta a 5-7 lavados de 10 minutos cada uno. Alternativamente, añade 0.1% SDS a TBST (añade 100 μL de SDS al 10% a 100 mL de TBST) para lavado más riguroso. SDS ayuda a remover anticuerpos unidos no específicamente.
3
Enjuague final (Opcional):Para detección quimioluminiscente, realiza un enjuague final rápido (30 segundos a 1 minuto) con TBS (sin Tween-20). Esto remueve Tween-20 residual que puede interferir con algunos sustratos ECL. Drena el exceso de TBS antes de proceder a la detección.

Tips:

Los lavados de anticuerpo secundario son más críticos - el anticuerpo secundario no unido causa alto fondo
Monitorea el fondo durante el lavado - si todavía es alto después de 5 lavados, extiende el lavado
Para detección fluorescente, el enjuague final con TBS generalmente no es necesario
No laves en exceso - el lavado excesivo puede reducir la señal específica

Washing Optimization:

If Background is High:

Aumenta el número de lavados: 5-7 lavados en lugar de 3-5
Aumenta la duración del lavado: 10 minutos por lavado en lugar de 5 minutos
Añade 0.1% SDS al buffer de lavado: Prepara TBST con 0.1% SDS (añade 100 μL de SDS al 10% por 100 mL de TBST)
Usa TBS para lavados finales: Reemplaza TBST con TBS (sin Tween-20) para los últimos 2-3 lavados
Aumenta el volumen de lavado: Usa 50-100 mL por lavado en lugar de 20-50 mL
Verifica concentraciones de anticuerpos: El fondo alto puede indicar que la concentración de anticuerpo es demasiado alta

If Signal Becomes Weak After Washing:

Reduce el número de lavados: Prueba 3 lavados en lugar de 5
Reduce la duración del lavado: Prueba 3 minutos por lavado en lugar de 5 minutos
Verifica la unión de anticuerpos: La señal débil puede indicar unión deficiente del anticuerpo primario - verifica con control positivo
Verifica que el anticuerpo no se esté lavando: Algunos anticuerpos tienen unión más débil - reduce la rigurosidad del lavado
Verifica reactivos de detección: Asegura que el sustrato ECL o reactivos de detección fluorescente sean frescos y funcionen

Métodos de detección

La detección es el paso final del western blot. Selecciona el método de detección apropiado basado en tu equipo disponible y requisitos de sensibilidad.

Detección quimioluminiscente - Protocolo detallado

El método más común y sensible. Usa sustratos ECL (quimioluminiscencia mejorada) que producen luz cuando se activan por HRP.

1
Preparar sustrato ECL:Mezcla los componentes del sustrato ECL según las instrucciones del fabricante. La mayoría de los kits ECL tienen 2 componentes (luminol y peróxido de hidrógeno) que se mezclan 1:1 justo antes del uso. Mezcla volúmenes iguales y usa inmediatamente.
2
Incubar membrana:Coloca la membrana con la cara de proteínas hacia arriba en una superficie limpia. Añade sustrato ECL a la membrana por pipeteo, asegurando cobertura completa. Incuba a temperatura ambiente durante 1-5 minutos. Incubación más larga (hasta 5 minutos) puede aumentar la señal pero también puede aumentar el fondo.
3
Eliminar sustrato excesivo:Inclina la membrana para drenar el sustrato excesivo. No dejes que la membrana se seque. Envuelve en plástico o coloca en casete de imagen. Asegura que no haya burbujas de aire entre la membrana y el plástico.
4
Capturar imagen:Para película de rayos X: Expone la película durante 1 segundo a 10 minutos dependiendo de la intensidad de la señal. Comienza con exposición corta (1-5 segundos) y ajusta. Revela la película según las instrucciones del fabricante. Para cámara CCD: Coloca en el sistema de imagen y captura la imagen. Ajusta el tiempo de exposición para evitar saturación.
5
Múltiples exposiciones:Toma múltiples exposiciones en diferentes tiempos para capturar tanto bandas fuertes como débiles dentro del rango lineal. Registra el tiempo de exposición para cada imagen.

Detección fluorescente - Protocolo detallado

Cuantitativa, no requiere película. Permite detección múltiple. Requiere sistema de imagen especializado.

1
Selección de anticuerpo secundario:Usa anticuerpo secundario etiquetado fluorescentemente. Opciones comunes: IRDye 680/800 (LI-COR), Alexa Fluor 488/555/647, o conjugados DyLight. Para detectar múltiples proteínas, selecciona colorantes con longitudes de onda de emisión que no se superpongan.
2
Incubación:Incuba la membrana con anticuerpo secundario fluorescente como se describe en la sección de incubación con anticuerpos. Protege de la luz durante y después de la incubación para prevenir fotoblanqueo.
3
Lavado:Lava exhaustivamente con TBST como se describe. El lavado final puede hacerse con TBS para reducir el fondo fluorescente.
4
Escanear:Escanea la membrana a la longitud de onda láser apropiada para tu fluoróforo. Para IRDye: canales 680nm y 800nm. Para Alexa Fluor: usa la longitud de onda de excitación apropiada. Ajusta la potencia del láser y resolución de escaneo para la mejor señal.
5
Análisis de imagen:Usa el software de imagen para cuantificar la intensidad de las bandas. La mayoría de los sistemas proporcionan herramientas de cuantificación integradas. Asegura que todas las bandas estén dentro del rango de detección lineal.

Detección colorimétrica - Protocolo detallado

Método simple usando sustratos cromogénicos para producir bandas coloreadas. No requiere equipo especial pero es menos sensible que otros métodos.

1
Preparar sustrato:Prepara el sustrato cromogénico según las instrucciones del fabricante. Mezcla los componentes justo antes del uso.
2
Añadir sustrato:Añade el sustrato a la membrana y monitorea el desarrollo del color. Las bandas aparecerán gradualmente.
3
Detener la reacción:Detén la reacción enjuagando con agua destilada cuando las bandas sean visibles y antes de que el fondo se desarrolle. Documenta inmediatamente ya que el color puede desvanecerse.

Cuantificación de Western Blot

La cuantificación precisa requiere normalización apropiada y métodos de análisis. Esta sección describe métodos detallados para cuantificar resultados de western blot.

Análisis con ImageJ (gratuito, código abierto):

1
Abre la imagen en ImageJ (Archivo > Abrir). Convierte a escala de grises de 8 bits o 16 bits si es necesario (Imagen > Tipo > 8 bits).
2
Dibuja un rectángulo alrededor de la primera banda usando la herramienta Rectángulo. Ve a Analizar > Geles > Seleccionar primer carril (o presiona "1").
3
Mueve el rectángulo a la siguiente banda y presiona "2" para el segundo carril. Repite para todas las bandas en el carril.
4
Después de seleccionar todas las bandas en el primer carril, presiona "3" para mover al siguiente carril. Repite el proceso de selección.
5
Una vez que todas las bandas están seleccionadas, ve a Analizar > Geles > Trazar carriles. Esto crea perfiles de intensidad.
6
Usa la herramienta Varita para seleccionar picos y medir el área bajo la curva (densidad integrada).
7
Registra valores para cada banda. Calcula relaciones y normaliza como se describe arriba.

Consejos y mejores prácticas de cuantificación

Asegura que todas las muestras estén dentro del rango de detección lineal - las bandas saturadas no pueden cuantificarse con precisión
Usa el mismo tiempo de exposición para todas las muestras cuando uses quimioluminiscencia - diferentes exposiciones hacen inválida la comparación
Incluye múltiples réplicas biológicas (al menos n=3) - las réplicas técnicas no son suficientes
Usa análisis estadístico apropiado - consulta con bioestadístico si no estás seguro
Documenta todos los parámetros de análisis (tiempo de exposición, configuraciones de software, método de normalización)
Valida que el control de carga es apropiado para tus condiciones experimentales
Considera usar normalización de proteína total como alternativa o complemento al control de carga
Ten en cuenta que los cambios de pliegue pueden subestimarse si el control de carga varía entre condiciones
Para publicación, incluye imágenes en bruto y datos de cuantificación en materiales suplementarios

Guía de resolución de problemas de Western Blot

Problemas comunes y soluciones en experimentos de western blot.

Sin señal o señal débil

Concentración de anticuerpo primario demasiado baja:

Aumenta la concentración de anticuerpo o extiende el tiempo de incubación

Proteína no transferida a la membrana:

Verifica la eficiencia de transferencia tiñendo la membrana con Ponceau S. Optimiza las condiciones de transferencia.

Anticuerpo no específico para el objetivo:

Verifica la especificidad del anticuerpo con controles positivos y negativos

Reactivo de detección expirado o almacenado incorrectamente:

Usa reactivos de detección frescos, almacena según las instrucciones del fabricante

Fondo alto

Bloqueo insuficiente:

Aumenta el tiempo de bloqueo a 2 horas o usa concentración más alta (10% leche)

Concentración de anticuerpo demasiado alta:

Diluye los anticuerpos más, optimiza mediante titulación

Lavado insuficiente:

Aumenta el número y duración de lavados, añade 0.1% SDS al buffer de lavado

Contaminación de membrana:

Usa pinzas limpias, evita tocar la membrana con las manos desnudas

Bandas no específicas

Reactividad cruzada de anticuerpos:

Usa anticuerpo más específico o anticuerpo secundario pre-adsorbido

Degradación de proteínas:

Usa muestras frescas, añade inhibidores de proteasas

Desnaturalización incompleta:

Asegura que las muestras se calienten a 95°C durante 5 minutos

Transferencia incompleta

Proteínas grandes (>100 kDa) no se transfieren:

Extiende el tiempo de transferencia a 2-3 horas, reduce la concentración de metanol al 10%, añade 0.1% SDS al buffer de transferencia, o usa voltaje más bajo (70-80V) por más tiempo. Considera usar membrana de tamaño de poro 0.2 μm.

Proteínas pequeñas (<20 kDa) pasan a través de la membrana:

Reduce el tiempo de transferencia a 30-45 minutos, aumenta el metanol al 25%, o usa membrana de tamaño de poro 0.2 μm en lugar de 0.45 μm. Verifica con tinción Ponceau S.

Transferencia desigual a través de la membrana:

Asegura buen contacto entre gel y membrana, elimina todas las burbujas de aire rodando con tubo de ensayo, verifica que el stack de transferencia esté montado correctamente, asegura que el buffer esté bien agitado durante la transferencia

Estrategias de optimización de protocolos

Enfoque sistemático para optimizar protocolos de western blot para mejores resultados. Cambia un parámetro a la vez y documenta todos los cambios. Esta guía completa proporciona estrategias basadas en evidencia para mejorar la relación señal-ruido, mejorar la reproducibilidad y lograr resultados de calidad para publicación.

Sample Optimization - Detailed Guide

Optimiza la preparación de muestras para asegurar máximo rendimiento y calidad de proteínas. La optimización de muestras es la base del western blot exitoso - la calidad deficiente de muestras no puede compensarse con pasos posteriores.

Selección de buffer de lisis:

Buffer RIPA: Más común, bueno para la mayoría de las proteínas, contiene detergentes (NP-40, desoxicólato, SDS) para lisis completa. Mejor para proteínas citoplasmáticas y nucleares. Puede ser demasiado agresivo para algunas proteínas de membrana.
Buffer NP-40: Más suave, bueno para proteínas de membrana y complejos proteicos, menos desnaturalizante. Preserva mejor las interacciones proteína-proteína que RIPA.
Buffer Laemmli: Lisis directa, no se necesita paso de lisis separado. Método más rápido pero puede no extraer todas las proteínas eficientemente.
Buffer urea/tiourea: Para proteínas difíciles de solubilizar, especialmente proteínas de membrana. Requiere ajuste cuidadoso de pH.
Prueba diferentes buffers sistemáticamente para encontrar el mejor para tu proteína

Comienza con RIPA para la mayoría de las aplicaciones. Si la señal es débil o la proteína parece degradada, prueba NP-40. Para proteínas de membrana, prueba NP-40 primero. Para proteínas nucleares, puede necesitar condiciones más agresivas o extracción secuencial. Para proteínas fosforiladas, asegura que se incluyan inhibidores de fosfatasas.

Concentración de proteína:

Carga típica: 20-50 μg de proteína total por pocillo para la mayoría de las aplicaciones
Para proteínas altamente expresadas (ej: actina, tubulina): 10-20 μg a menudo es suficiente
Para proteínas de baja abundancia (ej: factores de transcripción, quinasas): 50-100 μg pueden ser necesarios
Para proteínas de muy baja abundancia: Hasta 150 μg, pero monitorea difuminado y artefactos
Demasiada proteína (>100 μg) causa difuminado, resolución deficiente y puede saturar la detección
Muy poca proteína (<10 μg) puede no ser detectable, especialmente para objetivos de baja abundancia

Comienza con 30 μg como línea base. Si la señal es débil, aumenta a 50-75 μg. Si las bandas están difuminadas o la resolución es deficiente, disminuye a 20-25 μg. Para comparaciones cuantitativas, asegura que todas las muestras tengan concentraciones idénticas de proteína. Usa ensayo BCA o Bradford para cuantificación precisa - no estimes.

Relación de buffer de muestra:

Estándar: 3 partes de muestra a 1 parte de buffer de muestra 4X (concentración final 1X)
Para muestras concentradas (>10 mg/mL): Puede necesitar diluir la muestra antes de añadir buffer para evitar sobre-concentración
Para muestras diluidas (<1 mg/mL): Puede necesitar concentrar antes de añadir buffer, o usar buffer de muestra 2X
Asegura que la concentración final de SDS sea adecuada (0.1-0.2%) para desnaturalización apropiada
La concentración final de glicerol (5-10%) ayuda a que las muestras se hundan en los pocillos

Si las bandas no son nítidas o las proteínas parecen agregadas, aumenta la relación de buffer de muestra o asegura calentamiento apropiado. Si las muestras son demasiado viscosas, diluye apropiadamente. Siempre añade agente reductor fresco (2-ME o DTT) justo antes del calentamiento.

Condiciones de calentamiento:

Estándar: 95°C durante 5 minutos - funciona para la mayoría de las proteínas, asegura desnaturalización completa
Alternativa: 70°C durante 10 minutos - más suave, para proteínas sensibles a la temperatura que se agregan a 95°C
Algunas proteínas pueden agregarse a alta temperatura - prueba 60°C, 70°C, 80°C, 95°C para encontrar óptimo
Para proteínas de membrana: A veces 37°C durante 30 minutos funciona mejor que alta temperatura
Nunca omitas el calentamiento - desnaturalización incompleta causa migración deficiente y artefactos

Si ves múltiples bandas o difuminado que sugiere agregación, prueba temperaturas más bajas. Si las bandas no son nítidas o la migración es inconsistente, asegura que el calentamiento esté completo (verifica que las muestras estén realmente a temperatura). Usa un bloque de calor o baño de agua - el calentamiento en microondas es inconsistente.

Adición de inhibidores:

Siempre añade inhibidores frescos justo antes del uso - se degradan con el tiempo
Inhibidores de proteasas: PMSF (1 mM), o cóctel comercial (sigue las instrucciones del fabricante)
Inhibidores de fosfatasas: NaF (10-50 mM), Na3VO4 (1-2 mM), o cóctel comercial
Para proteínas fosforiladas: Los inhibidores de fosfatasas son críticos - añade al buffer de lisis inmediatamente
Almacena los stocks de inhibidores apropiadamente: PMSF en isopropanol, Na3VO4 en agua, cócteles como se recomienda

Si ves productos de degradación (múltiples bandas de menor peso molecular), aumenta la concentración de inhibidor de proteasas o prueba diferentes inhibidores. Si la señal de fosforilación es débil o inconsistente, asegura que los inhibidores de fosfatasas sean frescos y estén a la concentración correcta.

Optimización de gel - Guía detallada

Optimiza las condiciones del gel para la mejor separación de proteínas. La optimización del gel afecta directamente la resolución, lo que determina tu capacidad de detectar proteínas específicas y distinguirlas de bandas no específicas.

La optimización apropiada del gel asegura: (1) Separación óptima de proteínas basada en peso molecular, (2) Bandas nítidas y bien resueltas, (3) Distancia de migración apropiada para tu proteína objetivo, (4) Artefactos y difuminado mínimos

Porcentaje de gel:

El porcentaje de gel determina el tamaño de poro y afecta directamente la migración de proteínas. El porcentaje óptimo permite que tu proteína migre al tercio medio del gel de resolución para la mejor resolución.

Comienza con gel al 10% (más versátil, funciona para proteínas de 30-100 kDa). Para proteínas <20 kDa, aumenta a 15-20% para mejor separación. Para proteínas >100 kDa, disminuye a 6-8% para permitir migración. Prueba diferentes porcentajes sistemáticamente: prepara geles al 8%, 10%, 12%, 15% y ejecuta la misma muestra para comparar resolución.

Proteínas <20 kDa: Usa geles al 15-20%. Mayor porcentaje crea poros más pequeños, proporcionando mejor separación para proteínas pequeñas. Ejemplo: Histonas, péptidos pequeños, productos de degradación.:

Proteínas 20-100 kDa: Usa geles al 10-12%. Este es el rango más común. Ejemplo: La mayoría de proteínas de señalización, factores de transcripción, enzimas metabólicas.:

Proteínas 20-100 kDa: Usa geles al 10-12%. Este es el rango más común. Ejemplo: La mayoría de proteínas de señalización, factores de transcripción, enzimas metabólicas.

Proteínas >100 kDa: Usa geles al 6-8%. Menor porcentaje crea poros más grandes, permitiendo que las proteínas grandes migren. Ejemplo: Receptores, factores de transcripción grandes, proteínas estructurales.:

Si el tamaño de la proteína es desconocido: Comienza con 10%, o usa gel de gradiente (4-20% o 8-16%) para la mejor probabilidad de éxito.:

Si el tamaño de la proteína es desconocido: Comienza con 10%, o usa gel de gradiente (4-20% o 8-16%) para la mejor probabilidad de éxito.

Prepara geles al 8%, 10%, 12% y 15%. Carga muestras idénticas en cada uno. Compara: (1) Nitidez de bandas, (2) Distancia de migración (el objetivo debe estar en el tercio medio del gel), (3) Separación de otras bandas, (4) Resolución de marcadores de peso molecular. Elige el porcentaje que dé la mejor resolución para tu objetivo.

Geles de gradiente:

Los geles de gradiente proporcionan tamaños de poro variables a través del gel, ofreciendo mejor resolución para proteínas que abarcan amplios rangos de peso molecular.

Cuando se detectan múltiples proteínas de diferentes tamaños en el mismo gelCuando el tamaño de la proteína es desconocido o puede variar (ej: variantes de empalme)Cuando se optimiza una nueva proteína objetivoPara muestras complejas con muchas proteínas (ej: lisados celulares completos)

Espesor de gel:

El espesor del gel afecta la capacidad de proteínas, la resolución y las características de manejo.

Comienza con 1.0 mm para optimización. Si la resolución es deficiente y tienes muestra limitada, prueba 0.75 mm. Si la señal es débil y puedes cargar más, prueba 1.5 mm.

1.0 mm: Espesor estándar, buena resolución, fácil de manejar, más comúnmente usado (Capacidad estándar de proteínas (20-50 μg por pocillo típico)) - Recomendado para la mayoría de aplicaciones, especialmente cuando se optimiza
1.5 mm: Mayor capacidad de proteínas, puede cargar más muestra si es necesario (Mayor capacidad de proteínas (puede cargar hasta 100 μg si es necesario)) - Resolución ligeramente menor, los geles más gruesos corren más lento - Cuando necesitas cargar altas cantidades de proteína (objetivos de baja abundancia)
0.75 mm: Mayor resolución, ejecución más rápida, mejor para proteínas pequeñas (Menor capacidad de proteínas (10-30 μg por pocillo típico)) - Más frágil, más difícil de manejar, requiere carga cuidadosa - Para aplicaciones de alta resolución, proteínas pequeñas, o cuando la muestra es limitada

Condiciones de ejecución:

El voltaje y el tiempo de ejecución afectan la calidad de separación, la nitidez de las bandas y los artefactos potenciales.

Comienza con 100V voltaje constante como línea base. Si las bandas están borrosas o muestran "sonrisa" (migración curvada), reduce a 80V y ejecuta por más tiempo. Si la ejecución es demasiado lenta y las bandas son nítidas, puedes aumentar a 120V pero monitorea la temperatura de cerca. Para proteínas grandes (>100 kDa), siempre usa voltaje más bajo (60-80V) para prevenir sobrecalentamiento y mejorar la transferencia.

Calidad de preparación del gel:

La calidad de la preparación del gel afecta directamente la resolución y la reproducibilidad.

Problemas comunes del gel y soluciones:

Las bandas están borrosas o difuminadas:

Causes: Gel running too fast, Overloading, Incomplete polymerization, Temperature too high

Solutions: Reduce el voltaje, disminuye la carga de proteínas, asegura polimerización completa, usa enfriamiento

Bands migrate unevenly (smiling effect):

Causes: Gel not level, Buffer levels uneven, Temperature gradient, Gel thickness variation

Solutions: Nivela el aparato del gel, asegura niveles de buffer uniformes, mantén temperatura consistente, verifica espesor del gel

Poor resolution:

Causes: Wrong gel percentage, Incomplete polymerization, Running too fast, Gel too old

Solutions: Prueba diferentes porcentajes de gel, asegura polimerización completa, reduce el voltaje, usa gel fresco

Optimización de transferencia - Guía detallada