RIPA Lysis-Puffer

Radioimmunpräzipitations-Assay-Puffer - am häufigsten für Zelllyse beim Western Blotting verwendet

Components

• 50 mM Tris-HCl, pH 7,4
• 150 mM NaCl
• 1% NP-40 (oder IGEPAL CA-630)
• 0,5% Natriumdeoxycholat
• 0,1% SDS
• Frisch vor Gebrauch hinzufügen: 1 mM PMSF, Protease-Inhibitoren, Phosphatase-Inhibitoren

Preparation

Lösen Sie Komponenten in deionisiertem Wasser, passen Sie pH auf 7,4 an, filtern Sie steril, lagern Sie bei 4°C. Fügen Sie Inhibitoren kurz vor Gebrauch hinzu. Finales Volumen: 1 L.

Laemmli Probenpuffer (2X)

Standard-Probenpuffer für SDS-PAGE Elektrophorese

Components

• 125 mM Tris-HCl, pH 6,8
• 4% SDS
• 20% Glycerin
• 0,004% Bromphenolblau
• 10% 2-Mercaptoethanol (frisch hinzufügen, oder 100 mM DTT verwenden)

Preparation

Mischen Sie Komponenten (außer Reduktionsmittel), lagern Sie bei Raumtemperatur. Fügen Sie Reduktionsmittel kurz vor Gebrauch hinzu. Für 2X Puffer, mischen Sie 1:1 mit Probe. Für Reduktionsbedingungen, fügen Sie immer frisches 2-ME oder DTT hinzu.

Nasser Transfer-Puffer

Für Übertragung von Proteinen vom Gel auf PVDF oder Nitrocellulose-Membran

Components

• 25 mM Tris base
• 192 mM Glycin
• 20% Methanol (für PVDF-Membranen)
• 0,1% SDS (optional, für große Proteine >100 kDa)

Preparation

Lösen Sie 3,03 g Tris base und 14,4 g Glycin in 800 mL deionisiertem Wasser, fügen Sie 200 mL Methanol hinzu, passen Sie pH auf 8,3 an, bringen Sie auf 1 L. Lagern Sie bei 4°C. Für Nitrocellulose reduzieren Sie Methanol auf 10-15%.

TBST (Tris-gepufferte Salzlösung mit Tween-20)

Standard-Wasch- und Blockierungspuffer für Western Blotting

Components

• 20 mM Tris-HCl, pH 7,6
• 150 mM NaCl
• 0,1% Tween-20

Preparation

Lösen Sie 2,42 g Tris base und 8,77 g NaCl in 900 mL deionisiertem Wasser, passen Sie pH auf 7,6 mit HCl an, fügen Sie 1 mL Tween-20 hinzu, bringen Sie auf 1 L, mischen Sie gut. Lagern Sie bei Raumtemperatur.

5% Magermilch in TBST

Standard-Blockierungslösung für die meisten Western Blot Anwendungen

Preparation

Lösen Sie 5 g Magermilchpulver in 100 mL TBST. Mischen Sie gut, müssen möglicherweise durch Käsetuch filtern, um ungelöste Partikel zu entfernen. Bereiten Sie frisch zu oder lagern Sie bei 4°C für bis zu 1 Woche. Vor Gebrauch gut schütteln.

3-5% BSA in TBST

Blockierungslösung für phosphorylierte Proteine oder wenn Milch hohen Hintergrund verursacht

Preparation

Lösen Sie 3-5 g BSA (Rinderserumalbumin, Fraktion V) in 100 mL TBST. Mischen Sie vorsichtig, um Schaumbildung zu vermeiden. Filtern Sie durch 0,45 μm Filter falls erforderlich. Lagern Sie bei 4°C. Verwenden Sie innerhalb von 1 Woche.

Ponceau S-Färbelösung

Für Visualisierung von Protein-Transfer auf Membran

Components

• 0,1% Ponceau S
• 5% Essigsäure

Preparation

Lösen Sie 0,1 g Ponceau S in 100 mL 5% Essigsäure. Filtern Sie vor Gebrauch. Lagern Sie bei Raumtemperatur. Färben Sie Membran für 2-5 Minuten, spülen Sie mit Wasser, um Banden zu visualisieren.