Western Blot Hub

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Die richtige Probenvorbereitung ist entscheidend für erfolgreiches Western Blotting. Dieser Abschnitt behandelt detaillierte Methoden zur Vorbereitung von Proben aus verschiedenen Quellen mit Schritt-für-Schritt Anleitungen.

Zelllysat-Vorbereitung

Detailliertes Protokoll zur Vorbereitung von Proteinlysaten aus kultivierten Zellen. Geeignete Lysierungsbedingungen sind entscheidend, um die Proteinintegrität zu erhalten und Degradation zu verhindern.

1
Entfernen Sie das Kulturmedium und waschen Sie die Zellen 2-3 mal mit eiskaltem PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung). Stellen Sie sicher, dass alles PBS vollständig entfernt wird, um eine Verdünnung des Lysis-Puffers zu vermeiden. Für adhärente Zellen, fügen Sie PBS direkt zur Schale hinzu. Für Suspensionszellen, pelletieren Sie Zellen durch Zentrifugation bei 500-1000 × g für 5 Minuten.
2
Bereiten Sie Lysis-Puffer frisch zu oder verwenden Sie aliquoten Puffer, der bei -20°C gelagert wurde. Fügen Sie Protease-Inhibitoren (z.B. PMSF bei 1 mM Endkonzentration oder kommerzielles Protease-Inhibitor-Cocktail) und Phosphatase-Inhibitoren (z.B. NaF bei 10 mM, Na3VO4 bei 1 mM) kurz vor der Verwendung hinzu. Halten Sie den Puffer während des gesamten Prozesses eiskalt.
3
Fügen Sie geeignetes Volumen Lysis-Puffer hinzu (typischerweise 100-200 μL pro 10^6 Zellen oder 100-150 μL pro cm² Kulturschale). Für adhärente Zellen, kratzen Sie Zellen direkt im Lysis-Puffer mit einem Zellschaber ab. Für Suspensionszellen, resuspendieren Sie das Pellet im Lysis-Puffer. Übertragen Sie in ein vorgekühltes Mikrozentrifugenröhrchen.
4
Inkubieren Sie auf Eis für 20-30 Minuten mit gelegentlichem sanftem Vortexen alle 5-10 Minuten. Für schwer zu lysierende Zellen können Sie die Inkubation auf 45 Minuten verlängern oder Sonikation durchführen (3-5 Pulse von je 10 Sekunden auf Eis).
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Zentrifugieren Sie bei 12.000-14.000 × g für 15 Minuten bei 4°C. Dies entfernt Zelltrümmer, Kerne und unlösliches Material. Für einige Anwendungen müssen Sie möglicherweise bei höheren Geschwindigkeiten (20.000 × g) zentrifugieren oder sequenzielle Zentrifugationen durchführen.
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Sammeln Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Übertragen Sie in ein neues vorgekühltes Röhrchen. Vermeiden Sie das Sammeln von Pellet-Material, da es unlösliche Aggregate enthalten kann, die die Elektrophorese stören können.
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Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit BCA-, Bradford- oder Lowry-Assay. Bereiten Sie immer eine Standardkurve mit BSA-Standards vor. Verdünnen Sie Proben bei Bedarf, um in den linearen Bereich des Assays zu fallen. Typische Konzentrationen reichen von 1-10 mg/mL für Zelllysate.

Tips:

Arbeiten Sie schnell und halten Sie alles auf Eis, um Proteindegradation zu verhindern
Verwenden Sie frische Protease-Inhibitoren, da sie mit der Zeit abgebaut werden
Für phosphorylierte Proteine sind Phosphatase-Inhibitoren unerlässlich
Vermeiden Sie übermäßiges Vortexen, was Schaumbildung und Proteindenaturierung verursachen kann
Lagern Sie Lysate bei -80°C, wenn sie nicht sofort verwendet werden

Gewebeproben-Vorbereitung

Protokoll zur Vorbereitung von Proteinextrakten aus Gewebeproben. Gewebe-Homogenisierung erfordert kräftigere Methoden als Zelllyse.

1
Sammeln Sie frisches Gewebe und legen Sie es sofort auf Eis oder schockgefrieren Sie es in flüssigem Stickstoff. Für gefrorene Gewebe, halten Sie sie gefroren, bis sie verarbeitet werden. Schneiden Sie Gewebe in kleine Stücke (2-3 mm³) mit einem Skalpell oder Rasiermesser auf einer gekühlten Oberfläche.
2
Homogenisieren Sie Gewebe in eiskaltem Lysis-Puffer (typischerweise 10-20 Volumina Puffer pro Gewicht des Gewebes, z.B. 100 mg Gewebe in 1-2 mL Puffer). Verwenden Sie einen mechanischen Homogenisator, Mörser und Stößel oder Bead-Beating-System. Für zähe Gewebe, führen Sie Homogenisierung in mehreren kurzen Stößen (je 10-15 Sekunden) mit Kühlintervallen durch.
3
Inkubieren Sie das Homogenat auf Eis für 30 Minuten mit gelegentlichem Vortexen. Für faserige Gewebe, verlängern Sie die Inkubation auf 45-60 Minuten. Einige Gewebe können von kurzer Sonikation profitieren (3-5 Pulse von je 5 Sekunden auf Eis).
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Zentrifugieren Sie bei 12.000-14.000 × g für 20 Minuten bei 4°C. Für Gewebe mit hohem Lipidgehalt müssen Sie möglicherweise bei höheren Geschwindigkeiten zentrifugieren oder einen zusätzlichen Zentrifugationsschritt durchführen.
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Wenn der Überstand sichtbare Trümmer enthält oder trüb ist, filtern Sie durch einen 0,45 μm Spritzenfilter oder zentrifugieren Sie erneut. Einige Protokolle empfehlen Filtrierung durch Käsetuch oder feines Netz.
6
Bestimmen Sie die Proteinkonzentration. Gewebeextrakte haben typischerweise höhere Proteinkonzentrationen (5-20 mg/mL) als Zelllysate. Verdünnen Sie bei Bedarf für Quantifizierungs-Assay.

Tips:

Halten Sie Gewebe gefroren, bis zur Verarbeitung, um Proteindegradation zu verhindern
Verwenden Sie geeignete Homogenisierungsmethode für Gewebetyp
Einige Gewebe können zusätzliche Schritte erfordern, um Lipide oder Bindegewebe zu entfernen
Lagern Sie Extrakte bei -80°C in Aliquots, um Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden

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Proteinquantifizierung

Genaue Proteinquantifizierung ist unerlässlich für das Laden gleicher Proteinmengen. Verwenden Sie BCA-, Bradford- oder Lowry-Assay gemäß Herstelleranweisungen. Bereiten Sie immer eine Standardkurve für genaue Quantifizierung vor.

SDS-PAGE Elektrophorese

SDS-PAGE trennt Proteine basierend auf Molekulargewicht. Geeignete Gel-Vorbereitung und Laufbedingungen sind kritisch für die Auflösung. Dieser Abschnitt bietet detaillierte Schritt-für-Schritt Anleitungen zur Vorbereitung und Durchführung von SDS-PAGE Gelen.

Benötigte Materialien:

View Running Conditions Guide →

30% Acrylamid/Bis-Lösung (29:1 oder 37.5:1 Verhältnis)
1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 (für Auflösungsgel)
0,5 M Tris-HCl, pH 6,8 (für Sammelgel)
10% SDS (Natriumdodecylsulfat)
10% APS (Ammoniumpersulfat) - frisch zubereiten
TEMED (N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin)
Deionisiertes Wasser
Gel-Gießsystem (Glasplatten, Abstandshalter, Kämme)
Isopropanol oder wassergesättigtes Butanol (für Überlagerung)

Auflösungsgel-Vorbereitung (10% Beispiel):

1
Volumina berechnen:Für ein 10% Auflösungsgel (10 mL gesamt): Mischen Sie 3,3 mL 30% Acrylamid, 2,5 mL 1,5 M Tris-HCl pH 8,8, 0,1 mL 10% SDS, 4,05 mL deionisiertes Wasser. Entgasen Sie unter Vakuum für 10-15 Minuten, um gelösten Sauerstoff zu entfernen.
2
Polymerisationsmittel hinzufügen:Fügen Sie 50 μL 10% APS und 10 μL TEMED hinzu. Mischen Sie vorsichtig durch Schwenken (nicht vortexen, da dies Blasen einführt). Gießen Sie sofort in Gel-Kassette bis etwa 1 cm unterhalb, wo der Kamm sitzen wird.
3
Überlagerung:Überlagern Sie vorsichtig mit Isopropanol oder wassergesättigtem Butanol, um Sauerstoffkontakt zu verhindern und eine flache Gel-Oberfläche zu schaffen. Lassen Sie bei Raumtemperatur für 30-45 Minuten polymerisieren. Sie werden eine klare Grenzfläche sehen, wenn die Polymerisation abgeschlossen ist.
4
Überlagerung entfernen:Gießen Sie die Überlagerung ab und spülen Sie die Oberseite des Gels mit deionisiertem Wasser. Trocknen Sie die Oberseite mit Filterpapier, achten Sie darauf, das Gel nicht zu berühren.

Gel-Prozentsatz Richtlinien:

6-8%: Für Proteine >100 kDa (große Proteine)
10%: Für Proteine 30-100 kDa (am häufigsten, vielseitig)
12%: Für Proteine 15-60 kDa
15%: Für Proteine 10-40 kDa
18-20%: Für Proteine <20 kDa (kleine Proteine)

Sammelgel-Vorbereitung (5%):

1
Sammelgel-Lösung vorbereiten:Für 5% Sammelgel (4 mL gesamt): Mischen Sie 0,67 mL 30% Acrylamid, 1,0 mL 0,5 M Tris-HCl pH 6,8, 0,04 mL 10% SDS, 2,25 mL deionisiertes Wasser. Entgasen Sie, wenn Zeit vorhanden ist.
2
Polymerisationsmittel hinzufügen:Fügen Sie 25 μL 10% APS und 5 μL TEMED hinzu. Mischen Sie vorsichtig und gießen Sie sofort auf das Auflösungsgel.
3
Kamm einsetzen:Setzen Sie den Kamm schnell in einem Winkel ein, um Blasen zu vermeiden, dann gerade ausrichten. Lassen Sie für 20-30 Minuten polymerisieren. Das Gel sollte bereit sein, wenn Sie eine klare Linie an den Kammzähnen sehen können.
4
Kamm entfernen:Entfernen Sie den Kamm vorsichtig und spülen Sie die Wells mit Laufpuffer oder deionisiertem Wasser, um nicht polymerisiertes Acrylamid zu entfernen. Das Gel ist jetzt bereit für das Laden von Proben.

Probenladung:

1
Bereiten Sie Proben in Laemmli-Probenpuffer (1X Endkonzentration) mit 20-50 μg Protein pro Well vor. Für hoch exprimierte Proteine verwenden Sie 10-20 μg. Für niedrig abundante Proteine benötigen Sie möglicherweise 50-100 μg.
2
Fügen Sie Molekulargewicht-Marker in mindestens einem Well hinzu. Vorgefärbte Marker ermöglichen es Ihnen, den Fortschritt während der Elektrophorese zu überwachen.
3
Laden Sie Proben vorsichtig mit einer Pipette, vermeiden Sie Blasen. Laden Sie langsam, um zu verhindern, dass Proben in benachbarte Wells überlaufen.
4
Füllen Sie leere Wells mit 1X Probenpuffer, um gleichmäßige Stromverteilung zu gewährleisten.

Tipps für bessere Auflösung

Verwenden Sie frisches APS und TEMED für Gel-Polymerisation - alte Reagenzien funktionieren möglicherweise nicht richtig
Entgasen Sie Gel-Lösung vor dem Hinzufügen von APS, um Blasen zu verhindern, die die Gel-Struktur stören können
Lassen Sie das Gel vollständig polymerisieren, bevor Sie es verwenden - unvollständige Polymerisation verursacht schlechte Auflösung
Verwenden Sie geeigneten Gel-Prozentsatz für Ihre Proteingröße - falscher Prozentsatz führt zu schlechter Trennung
Halten Sie konsistente Temperatur während der Elektrophorese - Temperaturschwankungen beeinflussen die Migration
Stellen Sie sicher, dass Pufferniveaus ausreichend sind - niedriger Puffer verursacht ungleichmäßiges Laufen
Verwenden Sie frischen Laufpuffer - alter Puffer kann falschen pH oder Leitfähigkeit haben
Vermeiden Sie Überladung von Proben - zu viel Protein verursacht Band-Verschmierung
Laden Sie gleiche Volumina wenn möglich - verschiedene Volumina können Spuren-Verzerrung verursachen

Protein Transfer Methoden

Transfer von Proteinen vom Gel auf die Membran ist ein kritischer Schritt, der die Nachweisempfindlichkeit bestimmt. Dieser Abschnitt bietet detaillierte Protokolle für verschiedene Transfer-Methoden.

PVDF-Membran (Empfohlen):

1
Schneiden Sie die Membran auf Größe (etwas größer als das Gel)
2
Aktivieren Sie die Membran durch Eintauchen in 100% Methanol für 30 Sekunden
3
Übertragen Sie in Transfer-Puffer und äquilibrieren Sie für 5 Minuten
4
PVDF-Membranen haben bessere Proteinbindungskapazität und Haltbarkeit als Nitrocellulose

Nasser Transfer - Detailliertes Protokoll

Am häufigsten verwendete Methode, bietet ausgezeichnete Transfer-Effizienz für Proteine aller Größen. Am besten für große Proteine (>100 kDa).

Benötigte Materialien:

Transfer-Puffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 20% Methanol für PVDF)
PVDF oder Nitrocellulose-Membran
Filterpapier (Whatman 3MM oder gleichwertig)
Transfer-Schwämme oder -Polster
Transfer-Kassette
Transfer-Tank mit Kühlsystem
Eis oder Kältepack

1
Gel-Äquilibrierung:Nach Elektrophorese entfernen Sie das Gel vorsichtig von den Platten. Äquilibrieren Sie das Gel im Transfer-Puffer für 15-30 Minuten. Dies entfernt überschüssiges SDS und verbessert die Transfer-Effizienz. Schütteln Sie sanft während der Äquilibrierung.
2
Membran-Vorbereitung:Für PVDF: Auf Größe schneiden, in 100% Methanol für 30 Sekunden aktivieren, dann im Transfer-Puffer für 5 Minuten äquilibrieren. Für Nitrocellulose: Auf Größe schneiden und direkt im Transfer-Puffer für 5 Minuten befeuchten.
3
Transfer-Stack-Montage:Montieren Sie den Transfer-Stack in einer Schale gefüllt mit Transfer-Puffer. Von Kathode (schwarz, negativ) zu Anode (rot, positiv): (1) Schwamm, (2) 3 Filterpapiere, (3) Gel (mit der Vorderseite nach unten), (4) Membran (auf dem Gel), (5) 3 Filterpapiere, (6) Schwamm. Entfernen Sie ALLE Luftblasen durch Rollen mit einem Reagenzglas oder einem Roller. Luftblasen verhindern Protein-Transfer an dieser Stelle.
4
Transfer-Bedingungen:Platzieren Sie die Kassette im Transfer-Tank gefüllt mit kaltem Transfer-Puffer. Stellen Sie sicher, dass der Puffer die Kassette bedeckt. Für Standard-Transfers: 100V für 1 Stunde bei 4°C (mit Eis oder Kühlsystem). Für große Proteine: 70-80V für 2-3 Stunden. Für über Nacht: 30V über Nacht bei 4°C. Stellen Sie sicher, dass der Puffer kalt und gut gerührt ist während des Transfers.
5
Transfer-Verifizierung:Nach Transfer verifizieren Sie die Effizienz durch Färben der Membran mit Ponceau S (0,1% in 5% Essigsäure) für 2-5 Minuten. Spülen Sie mit Wasser, um Protein-Banden zu visualisieren. Dies bestätigt erfolgreichen Transfer, bevor Sie mit Blockierung fortfahren. Ponceau S kann mit TBST vor Blockierung abgewaschen werden.

Semi-Trockener Transfer - Detailliertes Protokoll

Schnellere Methode mit minimalem Puffer. Geeignet für kleine bis mittlere Proteine (<100 kDa). Weniger effizient für große Proteine.

1
Puffer-Vorbereitung:Bereiten Sie Anoden-Puffer vor: 0,3 M Tris, 20% Methanol, pH 10,4. Bereiten Sie Kathoden-Puffer vor: 25 mM Tris, 40 mM Glycin, 10% Methanol, 0,01% SDS, pH 9,4. Tränken Sie 3 Filterpapiere in jedem Puffer.
2
Stack-Montage auf Anode:Auf Anoden-Platte: Platzieren Sie 3 Filterpapiere getränkt in Anoden-Puffer. Platzieren Sie aktivierte PVDF-Membran oben (oder befeuchtete Nitrocellulose). Entfernen Sie Luftblasen durch Rollen.
3
Gel platzieren:Platzieren Sie das äquilibrierte Gel vorsichtig auf der Membran. Stellen Sie guten Kontakt sicher und entfernen Sie alle Luftblasen durch Rollen.
4
Stack vervollständigen:Platzieren Sie 3 Filterpapiere getränkt in Kathoden-Puffer auf dem Gel. Entfernen Sie Luftblasen. Schließen Sie das Transfer-Gerät.
5
Transfer:Wenden Sie konstanten Strom an: 0,8-1,2 mA pro cm² Gel-Fläche. Für ein Standard-Mini-Gel (8 x 10 cm) verwenden Sie 15V für 30-60 Minuten. Überwachen Sie die Temperatur - semi-trockene Transfers können überhitzen. Verwenden Sie Kühlung, wenn die Temperatur 30°C überschreitet.

Blockierung und Antikörper-Inkubation

Geeignete Blockierungs- und Antikörper-Bedingungen sind unerlässlich für spezifischen Nachweis mit niedrigem Hintergrund. Dieser Abschnitt bietet detaillierte Protokolle für jeden Schritt.

Blockierung - Detailliertes Protokoll

Blockierung verhindert unspezifische Bindung von Antikörpern an die Membran, reduziert Hintergrundsignal.

Blocking Solutions:

5% Magermilch in TBST (Standard):

Lösen Sie 5 g Magermilchpulver in 100 mL TBST. Mischen Sie gut, bis es gelöst ist. Möglicherweise müssen Sie durch Käsetuch filtern, um ungelöste Partikel zu entfernen. Bereiten Sie frisch zu oder lagern Sie bei 4°C für bis zu 1 Woche. Vor Gebrauch gut schütteln.

Applications: Die meisten allgemeinen Anwendungen, kosteneffektiv, funktioniert gut für die meisten Antikörper

Limitations: Enthält Casein, das mit phospho-spezifischen Antikörpern interferieren kann, kann hohen Hintergrund für einige Antikörper verursachen

3-5% BSA in TBST (Für phosphorylierte Proteine):

Lösen Sie 3-5 g BSA (Rinderserumalbumin, Fraktion V) in 100 mL TBST. Mischen Sie vorsichtig, um Schaumbildung zu vermeiden. Filtern Sie durch 0,45 μm Filter falls erforderlich. Lagern Sie bei 4°C. Verwenden Sie innerhalb von 1 Woche.

Applications: Phosphorylierte Proteine, wenn Milch hohen Hintergrund verursacht, einige empfindliche Antikörper

Advantages: Keine Casein-Interferenz, niedrigerer Hintergrund für Phospho-Antikörper, konsistenter

1
Blockierungslösung vorbereiten:Bereiten Sie Blockierungslösung frisch zu oder verwenden Sie gelagerte Lösung (Ablaufdatum prüfen). Für 5% Milch: Lösen Sie 5 g Magermilchpulver in 100 mL TBST. Mischen Sie gut durch Schwenken oder sanftes Umkehren, bis vollständig gelöst (5-10 Minuten). Wenn Partikel verbleiben, filtern Sie durch Käsetuch oder 0,45 μm Filter. Für BSA: Lösen Sie 3-5 g BSA in 100 mL TBST, mischen Sie vorsichtig, um Schaumbildung zu vermeiden. Lagern Sie bei 4°C, wenn nicht sofort verwendet.
2
Ponceau S-Färbung entfernen (Optional):Wenn Sie Transfer mit Ponceau S-Färbung verifiziert haben, waschen Sie die Membran kurz mit TBST (2-3 schnelle Spülungen, je 30 Sekunden), um Färbung zu entfernen. Dieser Schritt ist optional - Ponceau S kann belassen werden, da es während nachfolgender Waschungen entfernt wird. Lassen Sie überschüssiges TBST abtropfen, aber lassen Sie die Membran nicht trocknen.
3
Membran in Blockierungslösung übertragen:Platzieren Sie Membran mit Protein-Seite nach oben in Blockierungslösung. Verwenden Sie ausreichend Volumen, um Membran vollständig zu bedecken: Mini-Gel (8 x 10 cm) benötigt 10-20 mL, größere Membranen benötigen möglicherweise 30-50 mL. Stellen Sie sicher, dass Membran frei schwimmt und vollständig eingetaucht ist. Entfernen Sie alle Luftblasen durch sanftes Klopfen oder mit Pinzette.
4
Inkubieren mit sanfter Bewegung:Platzieren Sie Behälter auf einem Schüttler oder Rüttler mit sanfter Geschwindigkeit (20-30 rpm). Inkubieren Sie bei Raumtemperatur (20-25°C) für 1 Stunde. Bei hohem Hintergrund-Problemen verlängern Sie auf 2 Stunden oder verwenden Sie höhere Konzentration (10% Milch). Alternativ kann Blockierung bei 4°C über Nacht (12-16 Stunden) durchgeführt werden, wenn bequem - dies kann Blockierungseffizienz für einige Anwendungen verbessern.
5
Mit Primärantikörper fortfahren:Nach Blockierung waschen Sie die Membran nicht. Lassen Sie überschüssige Blockierungslösung abtropfen, indem Sie die Kante an Papiertuch berühren, aber lassen Sie die Membran nicht trocknen. Fahren Sie sofort mit Primärantikörper-Inkubation fort, verwenden Sie dieselbe Art von Blockierungslösung (Milch oder BSA) zum Verdünnen des Primärantikörpers.

Tips:

Stellen Sie sicher, dass Membran vollständig in Blockierungslösung eingetaucht ist - unzureichende Abdeckung verursacht hohen Hintergrund
Verwenden Sie sanftes Schütteln oder Rütteln (20-30 rpm) - zu kräftiges Schütteln kann Membran beschädigen oder ungleichmäßige Blockierung verursachen
Blockierung kann bei 4°C über Nacht durchgeführt werden, wenn bequem - dies kann Blockierungseffizienz verbessern
Für phosphorylierte Proteine verwenden Sie immer BSA, nicht Milch - Milch enthält Casein, das mit phospho-spezifischen Antikörpern interferiert
Bereiten Sie Blockierungslösung frisch zu, wenn möglich - gelagerte Lösungen können Wirksamkeit verlieren
Verwenden Sie ausreichend Volumen - Membran sollte frei schwimmen, nicht an Behälterwänden kleben
Wiederverwenden Sie Blockierungslösung nicht - sie kann übertragene Proteine oder Kontaminanten enthalten

Primärantikörper-Inkubation - Detailliertes Protokoll

Primärantikörper bindet spezifisch an Ihr Zielprotein. Geeignete Verdünnung und Inkubationsbedingungen sind kritisch.

Antikörper-Verdünnung:

Monoklonale Antikörper: Typischerweise 1:1000 bis 1:5000 in Blockierungslösung
Polyklonale Antikörper: Typischerweise 1:500 bis 1:2000 in Blockierungslösung
Beginnen Sie mit Hersteller-empfohlener Verdünnung, dann optimieren Sie durch Titration
Verdünnen Sie Antikörper in Blockierungslösung (dieselbe Lösung wie für Blockierung verwendet)

Optimization: Wenn Signal schwach ist: Konzentration erhöhen oder Inkubation verlängern. Wenn Hintergrund hoch ist: Konzentration verringern oder Blockierungszeit erhöhen.

Inkubationsbedingungen:

Über Nacht bei 4°C (Empfohlen)

Bestes Signal-zu-Rauschen-Verhältnis, empfindlichster Nachweis. Inkubieren Sie im Kälteraum oder Kühlschrank mit sanftem Schütteln oder Rütteln.

Duration: 12-16 Stunden

Advantages: Höhere Empfindlichkeit, besseres Signal-zu-Rauschen-Verhältnis, bequeme Zeitplanung

Raumtemperatur

Schnellere Methode, geeignet wenn über Nacht nicht möglich ist.

Duration: 1-2 Stunden mit sanftem Schütteln

Advantages: Schneller, bequem für Ergebnisse am selben Tag

Limitations: Kann leicht höheren Hintergrund haben, weniger empfindlich als über Nacht

Volume: Verwenden Sie ausreichend Volumen, um Membran zu bedecken (typischerweise 5-10 mL für Mini-Gel). Kann Antikörperlösung 2-3 mal wiederverwenden, wenn richtig bei 4°C mit Konservierungsmittel (0,02% Natriumazid) gelagert.

1
Antikörper-Verdünnung berechnen und vorbereiten:Bestimmen Sie benötigtes Volumen basierend auf Membrangröße: Mini-Gel (8 x 10 cm) benötigt 5-10 mL, größere Membranen benötigen 15-20 mL. Berechnen Sie benötigtes Antikörper-Volumen. Beispiel: Für 1:1000 Verdünnung in 5 mL, fügen Sie 5 μL Primärantikörper-Stammlösung zu 5 mL Blockierungslösung hinzu. Verwenden Sie eine Mikropipette für genaue Volumina. Mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren auf und ab oder Umkehren des Behälters 5-10 mal. Nicht vortexen, da dies Schaumbildung oder Denaturierung verursachen kann.
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Membran in Antikörperlösung übertragen:Nach Blockierung lassen Sie überschüssige Blockierungslösung abtropfen (lassen Sie Membran nicht trocknen). Platzieren Sie Membran mit Protein-Seite nach oben in Primärantikörperlösung. Stellen Sie sicher, dass Membran vollständig bedeckt und eingetaucht ist. Für kleine Membranen verwenden Sie einen verschließbaren Beutel (entfernen Sie Luftblasen vor dem Verschließen) oder kleinen Behälter. Für größere Membranen verwenden Sie eine Schale oder einen Behälter mit ausreichend Lösung, um vollständig zu bedecken. Beschriften Sie Behälter mit Antikörpername, Verdünnung und Datum.
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Bei gewählter Temperatur inkubieren:Für Über-Nacht-Inkubation (empfohlen): Platzieren Sie im Kälteraum oder Kühlschrank (4°C) mit sanftem Schütteln oder Rütteln (20-30 rpm) für 12-16 Stunden. Stellen Sie sicher, dass Behälter verschlossen ist, um Verdunstung zu verhindern. Für Raumtemperatur-Inkubation: Platzieren Sie auf Rüttler bei Raumtemperatur (20-25°C) mit sanftem Schütteln für 1-2 Stunden. Überwachen Sie Temperatur - vermeiden Sie Überhitzung. Über-Nacht-Inkubation bietet im Allgemeinen besseres Signal-zu-Rauschen-Verhältnis.
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Antikörperlösung speichern (Optional):Nach Inkubation kann Primärantikörperlösung zur Wiederverwendung gespeichert werden. Fügen Sie 0,02% Natriumazid hinzu (fügen Sie 10 μL von 10% Natriumazid pro 5 mL Lösung hinzu), um bakterielles Wachstum zu verhindern. Lagern Sie bei 4°C in verschlossenem Behälter. Beschriften Sie mit Antikörpername, Verdünnung, Datum und Anzahl der Verwendungen. Die meisten Antikörper können 2-3 mal wiederverwendet werden, aber Signal kann mit jeder Verwendung abnehmen. Verwerfen Sie, wenn Kontamination vermutet wird.
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Membran entfernen und mit Waschen fortfahren:Entfernen Sie Membran vorsichtig aus Antikörperlösung mit sauberer Pinzette. Lassen Sie überschüssige Lösung abtropfen, indem Sie Kante an Papiertuch berühren. Lassen Sie Membran nicht trocknen. Fahren Sie sofort mit Waschschritten fort. Waschen Sie Membran nicht vor diesem Punkt - Waschen vor Primärantikörper-Inkubation ist nicht notwendig und kann Signal reduzieren.

Tips:

Verdünnen Sie Primärantikörper immer in derselben Blockierungslösung, die für Blockierung verwendet wurde (Milch oder BSA)
Verwenden Sie ausreichend Volumen - unzureichendes Volumen verursacht ungleichmäßige Bindung und hohen Hintergrund
Über-Nacht-Inkubation bei 4°C wird für bestes Signal-zu-Rauschen-Verhältnis empfohlen
Schützen Sie vor Licht, wenn lichtempfindliche Antikörper verwendet werden
Beschriften Sie alle Behälter klar mit Antikörper-Informationen
Lassen Sie Membran zu keinem Zeitpunkt während des Prozesses trocknen
Kann Primärantikörperlösung 2-3 mal wiederverwenden, wenn richtig mit Natriumazid gelagert

Sekundärantikörper-Inkubation - Detailliertes Protokoll

Sekundärantikörper ist an ein Nachweismolekül (HRP, Fluoreszenzfarbstoff) konjugiert und bindet an den Primärantikörper.

Der Sekundärantikörper erkennt und bindet an den Primärantikörper und ermöglicht Nachweis durch sein konjugiertes Enzym (HRP) oder Fluoreszenz-Tag. Geeignete Auswahl, Verdünnung und Inkubationsbedingungen sind entscheidend für optimales Signal-zu-Rauschen-Verhältnis. Verwenden Sie immer spezies-übereinstimmende Sekundärantikörper (Anti-Kaninchen für Kaninchen-Primär, Anti-Maus für Maus-Primär) und bereiten Sie frische Lösungen für jedes Experiment vor.

Sekundärantikörper-Auswahl:

Muss spezifisch für die Spezies Ihres Primärantikörpers sein (z.B. Anti-Kaninchen für Kaninchen-Primär, Anti-Maus für Maus-Primär)
Verwenden Sie hochgradig kreuz-adsorbierte Sekundärantikörper, um Kreuzreaktivität zu minimieren
Wählen Sie geeignetes Konjugat: HRP für Chemilumineszenz, Fluoreszenzfarbstoffe (IRDye, Alexa Fluor) für Fluoreszenz
Für Multiplex-Nachweis verwenden Sie Sekundärantikörper mit verschiedenen Emissionswellenlängen

Verdünnungs-Richtlinien:

HRP-conjugated: HRP-konjugiert: 1:5000 bis 1:10000 in Blockierungslösung

Fluorescent: Fluoreszenz-markiert: Befolgen Sie Herstellerempfehlungen, typischerweise 1:5000 bis 1:15000

Optimization: Beginnen Sie mit Herstellerempfehlung, dann optimieren Sie. Zu hohe Konzentration verursacht hohen Hintergrund.

Beispiel-Berechnung: Für 1:5000 Verdünnung fügen Sie 1 μL Sekundärantikörper zu 5 mL Blockierungslösung hinzu. Für 1:10000 fügen Sie 0,5 μL zu 5 mL hinzu. Verwenden Sie eine Mikropipette für genaue Volumina. Mischen Sie vorsichtig durch Umkehren oder Pipettieren - vermeiden Sie Vortexen, da dies Schaumbildung verursachen kann.

Bereiten Sie Verdünnung in Blockierungslösung vor (dieselbe wie für Blockierungsschritt verwendet). Berechnen Sie benötigtes Volumen basierend auf Membrangröße: Mini-Gel (8 x 10 cm) benötigt 5-10 mL, größere Membranen benötigen möglicherweise 15-20 mL. Bereiten Sie immer frisch zu - verwenden Sie Sekundärantikörperlösungen niemals wieder, da sie abgebaut werden und hohen Hintergrund bei nachfolgenden Verwendungen verursachen.

1
Sekundärantikörperlösung vorbereiten:Berechnen Sie benötigtes Volumen (5-10 mL für Mini-Gel). Fügen Sie geeignetes Volumen Blockierungslösung zu sauberem Behälter hinzu. Verwenden Sie eine Mikropipette, fügen Sie berechnetes Volumen Sekundärantikörper-Stammlösung hinzu. Für 1:5000 Verdünnung in 5 mL: fügen Sie 1 μL Antikörper hinzu. Mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren auf und ab oder Umkehren des Behälters 5-10 mal. Nicht vortexen. Beschriften Sie Behälter mit Antikörpername, Verdünnung und Datum.
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Membran in Antikörperlösung übertragen:Nach Waschen des Primärantikörpers lassen Sie überschüssiges TBST kurz von Membran abtropfen (nicht trocknen lassen). Platzieren Sie Membran mit Protein-Seite nach oben in Sekundärantikörperlösung. Stellen Sie sicher, dass Membran vollständig eingetaucht ist. Für kleine Membranen verwenden Sie einen verschließbaren Beutel oder Behälter. Für größere Membranen verwenden Sie eine Schale oder einen Behälter mit ausreichend Lösung, um vollständig zu bedecken. Entfernen Sie alle Luftblasen durch sanftes Klopfen oder mit Pinzette.
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Mit sanfter Bewegung inkubieren:Platzieren Sie Behälter auf einem Rüttler oder Schüttler mit sanfter Geschwindigkeit (20-30 rpm). Inkubieren Sie bei Raumtemperatur (20-25°C) für 1 Stunde. Wenn fluoreszente Antikörper verwendet werden, wickeln Sie Behälter in Aluminiumfolie oder platzieren Sie in dunkler Box, um vor Licht zu schützen. Überwachen Sie Temperatur - vermeiden Sie Überhitzung, die Hintergrund erhöhen kann. Verlängern Sie Inkubation nicht über 1,5 Stunden hinaus, da dies Hintergrund ohne Verbesserung des Signals erhöht.
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Membran entfernen und mit Waschen fortfahren:Nach Inkubation entfernen Sie Membran vorsichtig aus Antikörperlösung mit sauberer Pinzette. Lassen Sie überschüssige Lösung abtropfen, indem Sie Kante an Papiertuch berühren. Lassen Sie Membran nicht trocknen. Fahren Sie sofort mit Waschschritten fort. Verwerfen Sie Sekundärantikörperlösung - verwenden Sie nicht wieder, da sie abgebaut wird und hohen Hintergrund bei nachfolgenden Verwendungen verursacht.

Tips:

Bereiten Sie Sekundärantikörper immer frisch zu - verwenden Sie Lösungen nicht wieder
Schützen Sie fluoreszente Antikörper vor Licht während und nach Inkubation
Verwenden Sie spezies-spezifische Sekundärantikörper, um Kreuzreaktivität zu vermeiden
Inkubieren Sie bei Raumtemperatur - 4°C Inkubation ist nicht notwendig und kann Signal reduzieren
Stellen Sie vollständige Abdeckung sicher - unzureichende Lösung verursacht ungleichmäßige Färbung
Verlängern Sie Inkubationszeit nicht unnötig - längere Inkubation erhöht Hintergrund ohne Verbesserung des Signals
Verwenden Sie sanfte Bewegung - zu kräftiges Schütteln kann Membran beschädigen oder ungleichmäßige Bindung verursachen

Waschen - Detailliertes Protokoll

Gründliches Waschen entfernt ungebundene Antikörper und reduziert Hintergrundsignal.

Geeignetes Waschen ist kritisch für das Entfernen ungebundener Primär- und Sekundärantikörper, was Hintergrundsignal erheblich reduziert und Signal-zu-Rauschen-Verhältnis verbessert. Waschen sollte gründlich, aber nicht übermäßig sein, da übermäßiges Waschen spezifisches Signal reduzieren kann. Verwenden Sie frisches TBST für jede Waschung und stellen Sie ausreichend Volumen sicher, um Membran vollständig zu bedecken.

Benötigte Materialien:

TBST (Tris-gepufferte Salzlösung mit 0,1% Tween-20)
TBS (Tris-gepufferte Salzlösung ohne Tween-20) - optional für finale Waschung
Waschbehälter oder Schale
Rüttelplattform oder Schüttler
Frisches TBST für jede Waschung (typischerweise 20-50 mL pro Waschung für Mini-Gel)

Nach Primärantikörper-Inkubation:

1
Erste Waschung:Entfernen Sie Membran aus Primärantikörperlösung mit sauberer Pinzette. Lassen Sie überschüssige Antikörperlösung abtropfen, indem Sie Kante an Papiertuch berühren. Platzieren Sie Membran sofort in frischem TBST (20-50 mL für Mini-Gel). Stellen Sie sicher, dass Membran vollständig eingetaucht ist. Platzieren Sie auf Rüttler mit sanfter Geschwindigkeit (20-30 rpm) für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
2
Nachfolgende Waschungen:Gießen Sie verwendetes TBST vollständig ab. Fügen Sie frisches TBST hinzu (20-50 mL). Setzen Sie Waschen für 5 Minuten mit sanftem Schütteln fort. Wiederholen Sie diesen Prozess insgesamt 3-5 mal (4-6 Waschungen einschließlich erster Waschung). Für die meisten Anwendungen sind 4-5 Waschungen von je 5 Minuten ausreichend.
3
Finale Primär-Waschung prüfen:Nach finaler Waschung lassen Sie überschüssiges TBST kurz abtropfen. Die Membran sollte bereit für Sekundärantikörper-Inkubation sein. Lassen Sie Membran nicht zwischen Waschungen oder vor Sekundärantikörper-Zugabe trocknen.

Tips:

Verwenden Sie immer frisches TBST für jede Waschung - Wiederverwendung von Waschpuffer reduziert Wirksamkeit
Stellen Sie ausreichend Volumen sicher - Membran sollte frei schwimmen, nicht an Behälter kleben
Halten Sie sanfte Bewegung aufrecht - zu kräftiges Schütteln kann Membran beschädigen
Verlängern Sie Waschzeit nicht unnötig - 5 Minuten pro Waschung ist Standard

Nach Sekundärantikörper-Inkubation:

1
Erste Waschungen:Entfernen Sie Membran aus Sekundärantikörperlösung. Lassen Sie überschüssige Lösung abtropfen. Platzieren Sie in frischem TBST (20-50 mL). Waschen Sie 3-5 mal für je 5 Minuten mit sanftem Schütteln, wechseln Sie TBST zwischen jeder Waschung. Dies entfernt ungebundenen Sekundärantikörper.
2
Erweiterte Waschungen für hohen Hintergrund:Wenn Hintergrund hoch ist, erhöhen Sie auf 5-7 Waschungen von je 10 Minuten. Alternativ fügen Sie 0,1% SDS zu TBST hinzu (fügen Sie 100 μL 10% SDS zu 100 mL TBST hinzu) für strengeres Waschen. SDS hilft, unspezifisch gebundene Antikörper zu entfernen.
3
Finale Spülung (Optional):Für chemilumineszente Nachweis führen Sie eine finale schnelle Spülung (30 Sekunden bis 1 Minute) mit TBS (ohne Tween-20) durch. Dies entfernt restliches Tween-20, das mit einigen ECL-Substraten interferieren kann. Lassen Sie überschüssiges TBS abtropfen, bevor Sie mit Nachweis fortfahren.

Tips:

Sekundärantikörper-Waschungen sind kritischer - ungebundener Sekundärantikörper verursacht hohen Hintergrund
Überwachen Sie Hintergrund während Waschen - wenn nach 5 Waschungen noch hoch, verlängern Sie Waschen
Für fluoreszente Nachweis ist finale TBS-Spülung normalerweise nicht notwendig
Überwaschen Sie nicht - übermäßiges Waschen kann spezifisches Signal reduzieren

Wasch-Optimierung:

Wenn Hintergrund hoch ist:

Anzahl der Waschungen erhöhen: 5-7 Waschungen statt 3-5
Waschdauer erhöhen: 10 Minuten pro Waschung statt 5 Minuten
0,1% SDS zu Waschpuffer hinzufügen: Bereiten Sie TBST mit 0,1% SDS vor (fügen Sie 100 μL 10% SDS pro 100 mL TBST hinzu)
TBS für finale Waschungen verwenden: Ersetzen Sie TBST mit TBS (ohne Tween-20) für letzte 2-3 Waschungen
Waschvolumen erhöhen: Verwenden Sie 50-100 mL pro Waschung statt 20-50 mL
Antikörperkonzentrationen prüfen: Hoher Hintergrund kann anzeigen, dass Antikörperkonzentration zu hoch ist

Wenn Signal nach Waschen schwach wird:

Anzahl der Waschungen reduzieren: Versuchen Sie 3 Waschungen statt 5
Waschdauer reduzieren: Versuchen Sie 3 Minuten pro Waschung statt 5 Minuten
Antikörperbindung prüfen: Schwaches Signal kann schlechte Primärantikörperbindung anzeigen - verifizieren Sie mit positiver Kontrolle
Verifizieren Sie, dass Antikörper nicht abgewaschen wird: Einige Antikörper haben schwächere Bindung - reduzieren Sie Waschstrenge
Nachweisreagenzien prüfen: Stellen Sie sicher, dass ECL-Substrat oder fluoreszente Nachweisreagenzien frisch und funktionierend sind

Nachweismethoden

Wählen Sie Nachweismethode basierend auf Ihrer Ausrüstung und Empfindlichkeitsanforderungen. Jede Methode hat spezifische Vorteile und Protokolle.

Chemilumineszenter Nachweis - Detailliertes Protokoll

Empfindlichste Methode, weit verbreitet. Erfordert ECL-Substrat und Röntgenfilm oder Bildgebungssystem. Bietet ausgezeichnete Empfindlichkeit und dynamischen Bereich.

1
ECL-Substrat vorbereiten:Mischen Sie ECL-Substrat-Komponenten gemäß Herstelleranweisungen. Die meisten ECL-Kits haben zwei Komponenten (Luminol und Peroxid), die 1:1 kurz vor Gebrauch gemischt werden. Mischen Sie gleiche Volumina und verwenden Sie sofort.
2
Membran inkubieren:Platzieren Sie Membran mit Protein-Seite nach oben auf sauberer Oberfläche. Pipettieren Sie ECL-Substrat auf Membran, stellen Sie vollständige Abdeckung sicher. Inkubieren Sie für 1-5 Minuten bei Raumtemperatur. Längere Inkubation (bis zu 5 Minuten) kann Signal erhöhen, kann aber auch Hintergrund erhöhen.
3
Überschüssiges Substrat entfernen:Lassen Sie überschüssiges Substrat abtropfen, indem Sie Membran kippen. Lassen Sie Membran nicht trocknen. Wickeln Sie in Plastikfolie ein oder platzieren Sie in Bildgebungskassette. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen zwischen Membran und Folie sind.
4
Bild erfassen:Für Röntgenfilm: Belichten Sie Film für 1 Sekunde bis 10 Minuten je nach Signalstärke. Beginnen Sie mit kurzer Belichtung (1-5 Sekunden) und passen Sie an. Entwickeln Sie Film gemäß Herstelleranweisungen. Für CCD-Kamera: Platzieren Sie in Bildgebungssystem und erfassen Sie Bild. Passen Sie Belichtungszeit an, um Sättigung zu vermeiden.
5
Mehrfachbelichtungen:Nehmen Sie mehrere Belichtungen zu verschiedenen Zeiten, um sicherzustellen, dass Sie sowohl starke als auch schwache Banden im linearen Bereich erfassen. Dokumentieren Sie Belichtungszeit für jedes Bild.

Fluoreszenter Nachweis - Detailliertes Protokoll

Quantitative Methode mit fluoreszenz-markierten Sekundärantikörpern. Kein Film erforderlich, ermöglicht Multiplex-Nachweis mit verschiedenen Farben.

1
Sekundärantikörper-Auswahl:Verwenden Sie fluoreszenz-markierte Sekundärantikörper. Häufige Optionen: IRDye 680/800 (LI-COR), Alexa Fluor 488/555/647 oder DyLight-Konjugate. Wählen Sie Wellenlängen, die nicht überlappen, wenn mehrere Proteine nachgewiesen werden.
2
Inkubation:Inkubieren Sie mit fluoreszentem Sekundärantikörper wie im Antikörper-Inkubations-Abschnitt beschrieben. Schützen Sie vor Licht während und nach Inkubation, um Photobleaching zu verhindern.
3
Waschen:Waschen Sie gründlich mit TBST wie beschrieben. Finale Waschung kann mit TBS sein, um Hintergrundfluoreszenz zu reduzieren.
4
Scannen:Scannen Sie Membran mit geeigneter Laserwellenlänge für Ihren Fluorophor. Für IRDye: 680 nm und 800 nm Kanäle. Für Alexa Fluor: verwenden Sie geeignete Anregungswellenlänge. Passen Sie Laserleistung und Scanauflösung für optimales Signal an.
5
Bildanalyse:Verwenden Sie Bildgebungssoftware, um Bandintensität zu quantifizieren. Die meisten Systeme bieten eingebaute Quantifizierungstools. Stellen Sie sicher, dass alle Banden im linearen Detektionsbereich sind.

Colorimetric Detection - Detailed Protocol

Simple method using chromogenic substrates that produce colored bands. No special equipment needed, but less sensitive than other methods.

1
Substrat vorbereiten:Bereiten Sie chromogenes Substrat gemäß Herstelleranweisungen vor. DAB (3,3'-Diaminobenzidin) erzeugt braune Banden. BCIP/NBT erzeugt violette/blaue Banden. TMB erzeugt blaue Banden.
2
Membran inkubieren:Platzieren Sie Membran in Substratlösung. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln. Banden erscheinen innerhalb von 5-30 Minuten je nach Signalstärke.
3
Reaktion stoppen:Stoppen Sie Reaktion, wenn Banden gewünschte Intensität erreichen, durch Waschen mit Wasser oder Stopplösung (falls bereitgestellt). Für DAB stoppen Sie mit Wasser. Für BCIP/NBT stoppen Sie mit Wasser, wenn Banden sichtbar sind.
4
Sofort dokumentieren:Dokumentieren Sie Ergebnisse sofort durch Scannen oder Fotografieren. Farbe kann mit der Zeit verblassen, besonders bei einigen Substraten.

Western Blot Quantifizierung

Genaue Quantifizierung erfordert geeignete Normalisierung und Analysemethoden. Dieser Abschnitt bietet detaillierte Protokolle zur Quantifizierung von Western Blot Ergebnissen.

ImageJ-Analyse (Kostenlos, Open Source):

1
Öffnen Sie Bild in ImageJ (Datei > Öffnen). Konvertieren Sie zu 8-bit oder 16-bit Graustufen falls erforderlich (Bild > Typ > 8-bit).
2
Zeichnen Sie Rechteck um erste Bande mit Rechteck-Werkzeug. Gehen Sie zu Analysieren > Gele > Erste Spur auswählen (oder drücken Sie '1').
3
Bewegen Sie Rechteck zur nächsten Bande und drücken Sie '2' für zweite Spur. Wiederholen Sie für alle Banden in der Spur.
4
Nach Auswahl aller Banden in erster Spur, drücken Sie '3' um zur nächsten Spur zu wechseln. Wiederholen Sie Auswahlprozess.
5
Sobald alle Banden ausgewählt sind, gehen Sie zu Analysieren > Gele > Spuren plotten. Dies erstellt Intensitätsprofile.
6
Verwenden Sie Zauberstab-Werkzeug, um Peaks auszuwählen und Fläche unter Kurve (integrierte Dichte) zu messen.
7
Notieren Sie Werte für jede Bande. Berechnen Sie Verhältnisse und normalisieren Sie wie oben beschrieben.

Quantifizierungs-Tipps und Best Practices

Stellen Sie sicher, dass alle Proben im linearen Detektionsbereich sind - gesättigte Banden können nicht genau quantifiziert werden
Verwenden Sie gleiche Belichtungszeit für alle Proben bei Chemilumineszenz - verschiedene Belichtungen machen Vergleich ungültig
Schließen Sie mehrere biologische Replikate ein (mindestens n=3) - technische Replikate sind nicht ausreichend
Verwenden Sie geeignete statistische Analyse - konsultieren Sie Biostatistiker wenn unsicher
Dokumentieren Sie alle Analyseparameter (Belichtungszeit, Softwareeinstellungen, Normalisierungsmethode)
Validieren Sie, dass Lade-Kontrolle für Ihre experimentellen Bedingungen geeignet ist
Erwägen Sie Verwendung von Gesamtprotein-Normalisierung als Alternative oder Ergänzung zu Lade-Kontrolle
Seien Sie sich bewusst, dass Faltungsänderungen unterschätzt werden können, wenn Lade-Kontrolle zwischen Bedingungen variiert
Für Veröffentlichung, schließen Sie Rohbilder und Quantifizierungsdaten in ergänzende Materialien ein

Western Blot Fehlerbehebungs-Leitfaden

Häufige Probleme und Lösungen bei Western Blot Experimenten.

Kein Signal oder schwaches Signal

Primärantikörper-Konzentration zu niedrig:

Erhöhen Sie Antikörperkonzentration oder verlängern Sie Inkubationszeit

Protein nicht auf Membran übertragen:

Prüfen Sie Transfer-Effizienz durch Färben der Membran mit Ponceau S. Optimieren Sie Transfer-Bedingungen.

Antikörper nicht spezifisch für Ziel:

Verifizieren Sie Antikörperspezifität mit positiven und negativen Kontrollen

Nachweisreagenz abgelaufen oder unsachgemäß gelagert:

Verwenden Sie frische Nachweisreagenzien, lagern Sie gemäß Herstelleranweisungen

Hoher Hintergrund

Unzureichende Blockierung:

Erhöhen Sie Blockierungszeit auf 2 Stunden oder verwenden Sie höhere Konzentration (10% Milch)

Antikörperkonzentration zu hoch:

Verdünnen Sie Antikörper weiter, optimieren Sie durch Titration

Unzureichendes Waschen:

Erhöhen Sie Anzahl und Dauer der Waschungen, fügen Sie 0,1% SDS zu Waschpuffer hinzu

Membran-Kontamination:

Verwenden Sie saubere Pinzette, vermeiden Sie Berühren der Membran mit bloßen Händen

Nicht-spezifische Banden

Antikörper-Kreuzreaktivität:

Verwenden Sie spezifischeren Antikörper oder vor-adsorbierten Sekundärantikörper

Proteindegradation:

Verwenden Sie frische Proben, fügen Sie Protease-Inhibitoren hinzu

Unvollständige Denaturierung:

Stellen Sie sicher, dass Proben bei 95°C für 5 Minuten erhitzt werden

Unvollständiger Transfer

Große Proteine (>100 kDa) übertragen nicht:

Verlängern Sie Transfer-Zeit auf 2-3 Stunden, reduzieren Sie Methanol-Konzentration auf 10%, fügen Sie 0,1% SDS zu Transfer-Puffer hinzu, oder verwenden Sie niedrigere Spannung (70-80V) für längere Zeit. Erwägen Sie Verwendung von 0,2 μm Porengröße Membran.

Kleine Proteine (<20 kDa) passieren Membran:

Reduzieren Sie Transfer-Zeit auf 30-45 Minuten, erhöhen Sie Methanol auf 25%, oder verwenden Sie 0,2 μm Porengröße Membran statt 0,45 μm. Verifizieren Sie mit Ponceau S-Färbung.

Ungleichmäßiger Transfer über Membran:

Stellen Sie guten Kontakt zwischen Gel und Membran sicher, entfernen Sie alle Luftblasen durch Rollen mit Reagenzglas, prüfen Sie, dass Transfer-Stack richtig montiert ist, stellen Sie sicher, dass Puffer während Transfer gut gerührt ist

Protokoll-Optimierungsstrategien

Systematischer Ansatz zur Optimierung von Western Blot Protokollen für beste Ergebnisse. Ändern Sie einen Parameter zur Zeit und dokumentieren Sie alle Änderungen. Dieser umfassende Leitfaden bietet evidenzbasierte Strategien zur Verbesserung des Signal-zu-Rauschen-Verhältnisses, Verbesserung der Reproduzierbarkeit und Erreichung von Veröffentlichungsqualität.

Proben-Optimierung - Detaillierter Leitfaden

Optimieren Sie Probenvorbereitung, um maximalen Ertrag und Proteinqualität sicherzustellen. Proben-Optimierung ist die Grundlage erfolgreichen Western Blotting - schlechte Probenqualität kann nicht durch spätere Schritte ausgeglichen werden.

Lysis-Puffer-Auswahl:

RIPA-Puffer: Am häufigsten, gut für die meisten Proteine, enthält Detergentien (NP-40, Deoxycholat, SDS) für vollständige Lyse. Am besten für zytoplasmatische und Kernproteine. Kann zu hart für einige Membranproteine sein.
NP-40-Puffer: Milder, gut für Membranproteine und Proteinkomplexe, weniger denaturierend. Erhält Protein-Protein-Wechselwirkungen besser als RIPA.
Laemmli-Puffer: Direkte Lyse, kein separater Lyse-Schritt erforderlich. Schnellste Methode, extrahiert aber möglicherweise nicht alle Proteine effizient.
Harnstoff/Thioharnstoff-Puffer: Für schwer lösliche Proteine, besonders Membranproteine. Erfordert sorgfältige pH-Anpassung.
Testen Sie verschiedene Puffer systematisch, um besten für Ihr Protein zu finden

RIPA: Am häufigsten verwendet, funktioniert für die meisten Proteine, enthält SDS, NP-40 und Deoxycholat
NP-40: Mild, für zytosolische Proteine, keine SDS, weniger denaturierend
Triton X-100: Ähnlich NP-40, für zytosolische Proteine
Für Membranproteine: Möglicherweise stärkere Bedingungen erforderlich (höhere SDS-Konzentration)
Für Kernproteine: Möglicherweise sequenzielle Extraktion erforderlich

Beginnen Sie mit RIPA für die meisten Anwendungen. Wenn Signal schwach ist oder Protein degradiert erscheint, testen Sie NP-40. Für Membranproteine versuchen Sie zuerst NP-40. Für Kernproteine benötigen Sie möglicherweise stärkere Bedingungen oder sequenzielle Extraktion. Für phosphorylierte Proteine stellen Sie sicher, dass Phosphatase-Inhibitoren enthalten sind.

Proteinkonzentration:

Typische Ladung: 20-50 μg Gesamtprotein pro Well für die meisten Anwendungen
Für hoch exprimierte Proteine (z.B. Actin, Tubulin): 10-20 μg ist oft ausreichend
Für niedrig abundante Proteine (z.B. Transkriptionsfaktoren, Kinasen): 50-100 μg können erforderlich sein
Für sehr niedrig abundante Proteine: Bis zu 150 μg, aber überwachen Sie auf Verschmierung und Artefakte
Zu viel Protein (>100 μg) verursacht Verschmierung, schlechte Auflösung und kann Nachweis sättigen
Zu wenig Protein (<10 μg) kann nicht nachweisbar sein, besonders für niedrig abundante Ziele

Beginnen Sie mit 30 μg als Basis. Wenn Signal schwach ist, erhöhen Sie auf 50-75 μg. Wenn Banden verschmiert sind oder Auflösung schlecht ist, reduzieren Sie auf 20-25 μg. Für quantitative Vergleiche stellen Sie sicher, dass alle Proben identische Proteinkonzentrationen haben. Verwenden Sie BCA- oder Bradford-Assay für genaue Quantifizierung - schätzen Sie nicht.

Probenpuffer-Verhältnis:

Standard: 3 Teile Probe zu 1 Teil 4X Probenpuffer (finale 1X Konzentration)
Für konzentrierte Proben (>10 mg/mL): Möglicherweise Probe vor Hinzufügen von Puffer verdünnen, um Überkonzentration zu vermeiden
Für verdünnte Proben (<1 mg/mL): Möglicherweise vor Hinzufügen von Puffer konzentrieren, oder 2X Probenpuffer verwenden
Stellen Sie sicher, dass finale SDS-Konzentration ausreichend ist (0,1-0,2%) für geeignete Denaturierung
Finale Glycerin-Konzentration (5-10%) hilft Proben in Wells zu sinken

Wenn Banden nicht scharf sind oder Proteine aggregiert erscheinen, erhöhen Sie Probenpuffer-Verhältnis oder stellen Sie geeignetes Erhitzen sicher. Wenn Proben zu viskos sind, verdünnen Sie entsprechend. Fügen Sie immer frisches Reduktionsmittel (2-ME oder DTT) kurz vor Erhitzen hinzu.

Erhitzungsbedingungen:

Standard: 95°C für 5 Minuten - funktioniert für die meisten Proteine, gewährleistet vollständige Denaturierung
Alternative: 70°C für 10 Minuten - sanfter, für temperatur-empfindliche Proteine, die bei 95°C aggregieren
Einige Proteine können bei hoher Temperatur aggregieren - testen Sie 60°C, 70°C, 80°C, 95°C um optimales zu finden
Für Membranproteine: Manchmal 37°C für 30 Minuten funktioniert besser als hohe Temperatur
Überspringen Sie Erhitzen niemals - unvollständige Denaturierung verursacht schlechte Migration und Artefakte

Wenn Sie mehrere Banden oder Verschmierung sehen, die Aggregation suggeriert, testen Sie niedrigere Temperaturen. Wenn Banden nicht scharf sind oder Migration inkonsistent ist, stellen Sie sicher, dass Erhitzen vollständig ist (prüfen Sie, dass Proben tatsächlich bei Temperatur sind). Verwenden Sie Heizblock oder Wasserbad - Mikrowellen-Erhitzen ist inkonsistent.

Inhibitor-Zugabe:

Fügen Sie immer frische Inhibitoren kurz vor Gebrauch hinzu - sie degradieren mit der Zeit
Protease-Inhibitoren: PMSF (1 mM) oder kommerzielles Cocktail (befolgen Sie Herstelleranweisungen)
Phosphatase-Inhibitoren: NaF (10-50 mM), Na3VO4 (1-2 mM) oder kommerzielles Cocktail
Für phosphorylierte Proteine: Phosphatase-Inhibitoren sind kritisch - fügen Sie sofort zu Lysis-Puffer hinzu
Lagern Sie Inhibitor-Stammlösungen richtig: PMSF in Isopropanol, Na3VO4 in Wasser, Cocktails wie empfohlen

Wenn Sie Degradationsprodukte sehen (mehrere niedrigere Molekulargewicht-Banden), erhöhen Sie Protease-Inhibitor-Konzentration oder versuchen Sie verschiedene Inhibitoren. Wenn Phosphorylierungs-Signal schwach oder inkonsistent ist, stellen Sie sicher, dass Phosphatase-Inhibitoren frisch und bei korrekter Konzentration sind.

Gel-Optimierung - Detaillierter Leitfaden

Optimieren Sie Gel-Bedingungen für beste Proteintrennung. Gel-Optimierung beeinflusst direkt die Auflösung, die Ihre Fähigkeit bestimmt, spezifische Proteine nachzuweisen und sie von nicht-spezifischen Banden zu unterscheiden.

Geeignete Gel-Optimierung gewährleistet: (1) Optimale Proteintrennung basierend auf Molekulargewicht, (2) Scharfe, gut aufgelöste Banden, (3) Geeignete Migrationsdistanz für Ihr Zielprotein, (4) Minimale Artefakte und Verschmierung

Gel-Prozentsatz:

Gel-Prozentsatz bestimmt Porengröße und beeinflusst direkt Proteinmigration. Der optimale Prozentsatz ermöglicht Ihrem Protein, in das mittlere Drittel des Auflösungsgels zu migrieren für beste Auflösung.

Beginnen Sie mit 10% Gel (am vielseitigsten, funktioniert für 30-100 kDa Proteine). Für Proteine <20 kDa, erhöhen Sie auf 15-20% für bessere Trennung. Für Proteine >100 kDa, reduzieren Sie auf 6-8% um Migration zu ermöglichen. Testen Sie verschiedene Prozentsätze systematisch: bereiten Sie 8%, 10%, 12%, 15% Gele vor und führen Sie dieselbe Probe aus, um Auflösung zu vergleichen.

Proteine <20 kDa: Verwenden Sie 15-20% Gele. Höherer Prozentsatz erzeugt kleinere Poren, bietet bessere Trennung für kleine Proteine. Beispiel: Histone, kleine Peptide, Degradationsprodukte.:

Proteine <20 kDa: Verwenden Sie 15-20% Gele. Höherer Prozentsatz erzeugt kleinere Poren, bietet bessere Trennung für kleine Proteine. Beispiel: Histone, kleine Peptide, Degradationsprodukte.

Proteine 20-100 kDa: Verwenden Sie 10-12% Gele. Dies ist der häufigste Bereich. Beispiel: Die meisten Signalisierungsproteine, Transkriptionsfaktoren, Stoffwechselenzyme.:

Proteine 20-100 kDa: Verwenden Sie 10-12% Gele. Dies ist der häufigste Bereich. Beispiel: Die meisten Signalisierungsproteine, Transkriptionsfaktoren, Stoffwechselenzyme.

Proteine >100 kDa: Verwenden Sie 6-8% Gele. Niedrigerer Prozentsatz erzeugt größere Poren, ermöglicht Migration großer Proteine. Beispiel: Rezeptoren, große Transkriptionsfaktoren, Strukturproteine.:

Wenn Proteingröße unbekannt ist: Beginnen Sie mit 10%, oder verwenden Sie Gradienten-Gel (4-20% oder 8-16%) für beste Erfolgschance.:

Wenn Proteingröße unbekannt ist: Beginnen Sie mit 10%, oder verwenden Sie Gradienten-Gel (4-20% oder 8-16%) für beste Erfolgschance.

Bereiten Sie 8%, 10%, 12% und 15% Gele vor. Laden Sie identische Proben auf jedes. Vergleichen Sie: (1) Bandenschärfe, (2) Migrationsdistanz (Ziel sollte im mittleren Drittel des Gels sein), (3) Trennung von anderen Banden, (4) Auflösung von Molekulargewicht-Markern. Wählen Sie Prozentsatz mit bester Auflösung für Ihr Ziel.

Gradienten-Gele:

Gradienten-Gele bieten variable Porengrößen über das Gel, bieten bessere Auflösung für Proteine, die breite Molekulargewicht-Bereiche umfassen.

Wenn mehrere Proteine verschiedener Größen auf demselben Gel nachgewiesen werdenWenn Proteingröße unbekannt ist oder variieren kann (z.B. Splice-Varianten)Wenn neues Zielprotein optimiert wirdFür komplexe Proben mit vielen Proteinen (z.B. Gesamtzelllysate)

Gel-Dicke:

Gel-Dicke beeinflusst Proteinkapazität, Auflösung und Handhabungseigenschaften.

Beginnen Sie mit 1,0 mm für Optimierung. Wenn Auflösung schlecht ist und Sie begrenzte Probe haben, versuchen Sie 0,75 mm. Wenn Signal schwach ist und Sie mehr laden können, versuchen Sie 1,5 mm.

1,0 mm: Standard-Dicke, gute Auflösung, leicht zu handhaben, am häufigsten verwendet (Standard-Proteinkapazität (20-50 μg pro Well typisch)) - Empfohlen für die meisten Anwendungen, besonders beim Optimieren
1,5 mm: Mehr Proteinkapazität, kann mehr Probe laden wenn nötig (Höhere Proteinkapazität (kann bis zu 100 μg laden wenn nötig)) - Etwas niedrigere Auflösung, dickere Gele laufen langsamer - Wenn Sie hohe Mengen Protein laden müssen (niedrig abundante Ziele)
0,75 mm: Höhere Auflösung, schnelleres Laufen, besser für kleine Proteine (Niedrigere Proteinkapazität (10-30 μg pro Well typisch)) - Zerbrechlicher, schwerer zu handhaben, erfordert sorgfältiges Laden - Für Hochauflösungs-Anwendungen, kleine Proteine oder wenn Probe begrenzt ist

Laufbedingungen:

Spannung und Laufzeit beeinflussen Trennungsqualität, Bandenschärfe und potenzielle Artefakte.

Beginnen Sie mit 100V konstanter Spannung als Basis. Wenn Banden verschwommen sind oder 'Lächeln' zeigen (gekrümmte Migration), reduzieren Sie auf 80V und laufen Sie länger. Wenn Laufen zu langsam ist und Banden scharf sind, können Sie auf 120V erhöhen, aber überwachen Sie Temperatur genau. Für große Proteine (>100 kDa) verwenden Sie immer niedrigere Spannung (60-80V), um Überhitzung zu verhindern und Transfer zu verbessern.

Gel-Vorbereitungsqualität:

Qualität der Gel-Vorbereitung beeinflusst direkt Auflösung und Reproduzierbarkeit.

Häufige Gel-Probleme und Lösungen:

Banden sind verschwommen oder verschmiert:

Causes: Gel läuft zu schnell, Überladung, Unvollständige Polymerisation, Temperatur zu hoch

Solutions: Reduzieren Sie Spannung, verringern Sie Proteinladung, stellen Sie vollständige Polymerisation sicher, verwenden Sie Kühlung

Banden migrieren ungleichmäßig (Lächeln-Effekt):

Causes: Gel nicht eben, Pufferniveaus ungleichmäßig, Temperaturgradient, Gel-Dicken-Variation

Solutions: Ebenen Sie Gel-Gerät, stellen Sie gleichmäßige Pufferniveaus sicher, halten Sie konsistente Temperatur aufrecht, prüfen Sie Gel-Dicke

Schlechte Auflösung:

Causes: Falscher Gel-Prozentsatz, Unvollständige Polymerisation, Zu schnell laufen, Gel zu alt

Solutions: Testen Sie verschiedene Gel-Prozentsätze, stellen Sie vollständige Polymerisation sicher, reduzieren Sie Spannung, verwenden Sie frisches Gel

Transfer-Optimierung - Detaillierter Leitfaden